发酵、酿造工艺实验讲义

1第六部分发酵、酿造工艺实验第一篇发酵工程设备发酵工程设备实验项目及其各专业必修、选修表实验序号实验项目实验学时实验类型实验类别面向专业（以下打“√”为必修，“＊”为选修，数字为开课学期）生科生技生工食品1小型生物反应器的安装与拆卸2验证√(6）√(5）2小型连续培养实验装置的设计组建3综合√(6）√(5）3体积溶氧传递系数的测定3综合√(6）√(5）4摇床培养确定酵母菌体培养条件8综合√(6）√(5）5反应器培养液的灭菌与接种培养8综合√(7）6pH电极、溶氧电极的校正2验证√(7）7生物制品的冷冻干燥6综合√(7）83M3机械搅拌通风发酵罐结构的认识4验证√(7）91M3中试发酵设备的操作方法12综合√(7）10面包酵母流加培养与分批培养试验24综合√(7）学时合计7272162第二篇酿造工艺学实验酿造工艺学实验项目及其各专业必修、选修表实验序号实验项目实验学时实验类型实验类别面向专业（以下打“√”为必修，“＊”为选修，数字为开课学期）生科生技生工食品1葡萄酒酿造过程24/14综合√(6）√(4）2葡萄酒结束理化指标的测定8/0综合√(6）√(4）3葡萄酒感官品评4/2综合√(6）√(4）4乳酸发酵工艺10/8综合√(6）√(4）5醋酸发酵工艺10/8综合√(6）√(4）学时合计56/325632第一篇发酵工程设备实验一小型生物反应器的安装与拆卸机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是生物工程设备的重要组成部分，在微生物工程、酶工程、细胞工程（细胞培养）、基因工程（基因工程菌）等科学研究领域，生物反应器均为生物技术转化为产品必要的设备。由于小型生物反应器进料、出料、清洗、电极校正等过程都不同于大型发酵罐，需要拆卸之后进行，因此熟悉生物反应器结构及安装与拆卸操作是正确使用反应器的前提。一、实验目的掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程，认识和了解生物反应器的结构与功能。二、基本原理生物反应器装置分两大部分：1.罐体及内部的各传感器、检测电极；2.罐外检测控制装置，蒸汽及无菌空气系统。反应器罐体具有可卸上盖，与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封。盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、温度传感器及溶氧电极和pH电极插口、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；罐外：连接各种传感器及电极相应的控制器，可以自动地调控试验所需的培养条件；连接无菌空气系统，并配备一台自动调控装置；连接蒸汽发生器，供灭菌使用。三、实验装置3L园柱形机械搅拌式生物反应器3图1机械通风式搅拌生物反应器四、实验步骤1.首先断开所有电源。2.卸下可移动的所有检测电极和探头。3.拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。4.插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。5.加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去），并对称拧紧螺母，直至上盖被密封固定。6.将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。7.检查检测系统的连接，调试密闭。8.作出3L机械通风搅拌式生物反应器的结构示意图，注明各装置名称。9.标注检测系统的连接。五、思考题1.小型生物反应器的安装和拆卸应该注意那些问题？2.pH电极、溶氧电极如何校正？实验二小型连续培养实验装置的设计组建连续培养是在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物，理论上对数生长期可无限延长。不同于分批培养发酵周期受培养基消耗殆尽的影响，连续培养使微生物在特定的环境中持续保持旺盛生长状态，随着培养基不断加入，产物不断生成排出，减少了非发酵时间，可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。常用的连续培养方法有恒浊法与恒化法两类，恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。本实验设计组建实验室恒化法培养装置，有助于对恒化法连续培养及装置特性加深理解。一、实验目的设计组建小型微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法。尾气4二、实验原理恒化法是通过控制培养基中营养物主要是生长限制因子的浓度来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。由于培养基质加入流量与产物流出的流量保持恒定，随着培养时间的推移，培养器中各物质浓度不随时间改变，称为恒化法，设计恒化器培养装置除满足液体深层培养所必须的条件外，着重在于满足上述条件。三、实验仪器与材料三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕动泵、橡胶管、磁力搅拌器、温度计、酒精喷灯四、实验步骤1.用实验室仪器设计一套恒化法连续培养装置（厌氧培养），并组建安装。2.画出你所组建的简单连续培养装置示意图并注明各装置的作用。3.设计出求算单级连续培养比生长速率的实验步骤及求算µ的过程。五、思考题1.在你组建的装置中如何实现培养器中基质浓度的恒定？如何保证培养过程无污染？2.连续发酵培养在工业生产与科研上的意义？实验三体积溶氧传递系数的测定单位体积发酵液氧传递系数kLa可称为“通气效率”，不同类型的发酵罐由于供氧装置的不同其体积溶氧传递系数不同，kLa大意味着反应器供给单位发酵液的氧的能力强。通过kLa的测定，可了解发酵过程中氧的传递效果的好坏，对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。一、实验目的学习运用亚硫酸盐法测定小型生物反应器的kLa值。二、基本原理用Cu2+为催化剂，溶解在水中的氧能立即将水中的SO32-氧化成为SO42-，其氧化反应的速度在很大范围内与SO32-的浓度几乎无关。因此氧化速率是控制氧化反应的因素。其反应式如下：2Na2SO3+O22Na2SO4剩余的Na2SO3与过量的碘作用Na2SO3+I2+H2ONa2SO4+2HI剩余的I2用标定的Na2S2O3溶液滴定。标准Na2S2O3溶液的用量取决于溶解氧的量。每1ml溶氧可氧化2molNa2SO3，也就消耗掉4molNa2S2O3。因此每消耗1molNa2S2O3（与对比样的体积差）必有1/4mol溶氧在通氧过程中参与反应。则：溶氧当量)/(460hLmoltmNVNVNv=KLa（c*-c）KLa=Nv/0.21三、实验仪器与材料3L生物反应器、250ml三角瓶、25ml移液管、滴定台、滴定管、Na2SO3、5CuSO4、碘溶液、Na2S2O3四、实验方法与步骤1.称取12.6gNa2SO3和0.072gCuSO4。按实验一方法打开发酵罐，将1L自来水加入到发酵罐中，开始搅拌，依次加入Na2SO3晶体和CuSO4，搅拌使完全溶解。取样10ml，作为未通气的对照组，注入预先准备好的过量的碘溶液中。2.安装好发酵罐，检查使密闭。开阀通气，打开搅拌器到常用转速。气阀开启迅速调至预定空气流量。当罐内溶液中有气泡冒出时，开始计时，作为通氧时间的开始。3.氧化时间持续10-20min，到预定时间停止通气和搅拌，准确记录通氧时间。4.取样10ml作为样液，注入预先准备好的过量的与对照组所注入的相同量的碘溶液中。5.在对照组与样液中分别加入淀粉溶液3滴作为指示剂，分别用标定的Na2S2O3溶液滴定，至碘溶液中蓝色消失。6.分别记录对照组与样液滴定所消耗Na2S2O3溶液的量。五、实验结果滴定前读数滴定后读数滴定消耗量△V对照液滴定V1=样液滴定V2=六、思考题1.kLa的大小受哪些因素的影响？2.测定kLa值其他方法有哪些？实验四摇床培养确定酵母菌体培养条件正交试验(Orthogonalexperimental)是研究多因素多水平的试验方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法，可大幅度减少试验工作量，因而正交试验在很多领域的研究中已经得到广泛应用。本实验即是利用正交试验的方法选择酵母最佳培养基以掌握正交试验的方法。一、实验目的通过摇瓶法确定发酵周期，学习应用正交法确定发酵培养基最佳配比。二、实验原理1.培养周期的确定。生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，可采用直接比浊法进行测定。摇瓶培养中通过定期取样测定酵母浓度，找出对数生长末期确定为培养终点。2.最佳培养基的确定。在碳源、氮源、无机盐初步确定的前提下，通过四因素三水平正交试验，可判断四因素组合时各因素的最佳浓度，从而确定最佳培养基。三、实验仪器与材料1.实验仪器：全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、超净工作台、高压灭菌锅、天平；250ml三角瓶、50ml三角瓶、移液管（移液枪）。2.试验材料：葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4。四、实验方法与步骤61.养基的配制(见表1，2)表1正交表试验设计（100ml）因素水平葡萄糖蔗糖酵母膏KH2PO411.00.00.50.522.01.01.01.033.02.02.02.0表2正交表实验方案编号葡萄糖(A)蔗糖(B)酵母膏(C)KH2PO4（D）生物量（OD）0h12h24h36h48h60h1(1)(1)(1)(1)2(1)(2)(2)(2)3(1)(3)(3)(3)4(2)(1)(2)(3)5(2)(2)(3)(1)6(2)(3)(1)(2)7(3)(1)(3)(2)8(3)(2)(1)(3)9(3)(3)(2)(1)K1K2K3极差R2.取250ml三角瓶将上述培养基配制200ml，取6个50ml三角瓶各装入培养基10ml，及剩余的培养基（用于测定时稀释，当OD值小于或大于）于121℃下灭菌30min，冷却。（制备无菌水）3.冷却后接种0.5ml（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。4.测OD值：将接种0h、12h、24h、36h、48h、60h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将OD值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。5.作各因素水平的K图。6.根据试验数据判定发酵时间及最佳培养基配比。五、思考题1.为什么要作K图？如果实验继续深入，应该改变那些因素水平，为什么？2.R值反应的是什么？有何意义？实验五反应器培养液的灭菌与接种培养小型台式玻璃生物反应器置于高压锅中灭菌，而金属制生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽加热灭菌的方式进行的。由于结构的差异小型生物反应器灭菌与大型发酵罐灭菌操作有一定的差别，小型生物反应器的上盖上有众多的电极接口，需防止蒸汽打湿；蒸汽的进出口路线也有所不同，需保证蒸汽进出7畅通。通过实际操作熟悉灭菌的过程。一、实验目的学习和掌握生物反应器灭菌与接种培养的操作，认识和掌握运用现代化反应器的操作规程及方法。二、实验原理将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。三、实验仪器与材料1.实验仪器5L升生物反应器、蒸汽发生器、反应器控制台、三角瓶；2.实验材料菌种：酵母菌；培养基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，无机盐。四、实验步骤与方法1.灭菌：在反应器安装就序后，接通电源，打开控制台总开关，开启冷却水阀，分别按下温度、pH、溶解氧、搅拌器开关键，调节搅拌器转速约120rpm，调整灭菌时间（30min），设置灭菌温度（121℃），同时，按下灭菌开关键。使电加热器对罐底夹套层进行加热，罐内温度逐渐上升，待温度升至105℃左右时，关闭废气出口阀。温度继续上升至灭菌温度，自动保温至设定时间后，由冷却水自动冷却至设置的发酵温度。2.培养条件的确定：通人反应器的空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计的流量调至确定值。3.接种与培养：将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭过菌的带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角