抗生素工艺学第六章发酵过程的控制

第五章发酵过程控制第一节发酵过程的主要控制参数第二节发酵过程的代谢变化第三节基质的影响及其控制第四节温度的影响与控制第五节pH的影响与控制第六节溶氧浓度的变化和控制第七节补料的作用及其控制第八节泡沫的影响与控制第九节发酵终点判断发酵过程原理一、发酵的基本概念1、微生物发酵利用微生物体来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。2、初级代谢产物关系到微生物新陈代谢过程中的能量代谢、细胞生长和细胞结构的代谢产物。3、次级代谢产物微生物菌体在生长期不能合成的、一般在菌体生长静止期中合成的与菌体成长繁殖无明显关系的产物。抗生素产生菌在一定条件下吸取营养物质，合成其自身菌体细胞，同时产生抗生素和其它代谢产物的过程，称为抗生素发酵。发酵过程是由各种酶系统的作用而发生的一系列生化反应，抗生素是这个过程的次级代谢产物。发酵方法微生物发酵有三种方式：分批发酵（batchfermentation）补料分批发酵（fed-batchfermentation）连续发酵（continuousfermentation）工业上防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。1、分批式发酵①理论基础把培养液一次性装入发酵罐，灭菌后接入一定量的种子液，在最佳条件下进行发酵培养。是产生菌体经过一定时间不同级数的种子培养，达到一定菌体量后，移种到发酵罐进行纯种和通气搅拌培养，到规定时间即行结束的过程。②优缺点：发酵周期短，产品质量易控制，不易发生杂菌污染，对原料组成要求较粗放。发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期营养物质浓度很低，这对发酵反应不利。2、补料分批发酵①理论基础在分批式操作的基础上，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程适当时期，开始连续补加碳源或氮源或其他必需物质，但不取出培养液，直到发酵终点，产率达最大化，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。。②优缺点：优点：在发酵过程中慢慢地加入培养基，使其在发酵液中保持适宜水平，同时又稀释了生成的产物浓度，避免了高浓度产物和底物的抑制作用，也防止了后期养分不足而限制菌体生长。缺点：受发酵罐操作容积的限制3、连续式发酵①理论基础菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中不断补充新培养基，同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条件，促进菌体的生长和产物的积累。②优缺点：连续培养优点：能维持基质浓度，可以提高设备的利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间，便于自动控制。但由于培养时间长，难以保证纯种培养。并且菌种变异可能性较大，故在工业规模上很少采用。发酵过程控制微生物发酵的生产水平取决于：1）生产菌种本身的特性；2）合适的环境条件，使它的生产能力充分表达出来。这些环境条件包括培养基、培养温度、pH、氧的需求等。为了掌握菌种在代谢过程中的代谢变化规律，需要监测一些参数，这些参数包括菌体浓度、糖、N消耗及产物浓度，培养温度、pH、溶氧等。第一节发酵过程的主要控制参数（一）物理参数（二）化学参数（三）生物参数一、发酵过程的主要控制参数（一）物理参数1．温度（℃）发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。酶反应速率、氧在培养液中的溶解度与传递速率、菌体生长速率和产物合成速率2．压力（Pa）发酵过程中发酵罐维持的压力,一般维持在0.2×105~0.5×105Pa。保证纯种的培养,间接影响菌体代谢。3．搅拌转速（r／min）搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每1min的转数来表示。它的大小与氧在发酵液中的传递速率与发酵液的均匀性有关。4．搅拌功率（kw）指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每1m3发酵液所消耗的功率（kw／m3）。它的大小与氧容量传递系数有关。5．空气流量［V／（V·min），简称VVM］每1min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.5～1.0V／（V·min）范围内。6．粘度（Pa·s）粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常用表观粘度表示之：它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。7．浊度（％）浊度是能及时反映单细胞生长状况的参数，对某些产品的生产是极其重要的参数。8.料液流量（L／min）这是控制流体进料的参数。（二）化学参数1．pH（酸碱度）发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。2．基质浓度（g或mg％）这是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总糖）、氮（氨基氮或氨氮）等基质的浓度。3．溶解氧浓度［10-6（ppm）或饱和度（％）］溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发醉中间控制的参数及设备供氧能力的指标。溶氧浓度一般用绝对含量（10-6）来表示、有时也用在相同条件下，氧在培养液中饱和浓度表示。4．产物的浓度[μg（u）／ml]这是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。5．废气中的氧浓度（Pa）废气中的氧含量与产生菌的摄氧率和供氧系数有关。从废气中的O2的含量可以算出产生菌的摄氧率和发酵罐的供氧能力。6．废气中的CO2浓度（％）废气中的CO2就是产生菌呼吸放出的CO2。测定它可以算出产生菌的呼吸熵，从而了解产生菌的呼吸代谢规律。其他化学参数：DNA、RNA、生物合成的关键酶等。（三）生物参数1．菌丝形态丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。2．菌体浓度菌体浓度简称菌浓，是控制微生物发酵的重要参数之一。大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响（表观粘度、溶氧浓度）。在生产上，常常根据菌体浓度来决定适合的补料量和供氧量，以保证生产达到顶期的水平。（发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和产物浓度等的变化值）计算（菌体的比生长速率、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生产速率）（控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件）研究发酵动力学第二节、发酵过程中的代谢变化1．菌体生长阶段（菌体生长期或发酵前期）菌体进行合成代谢：菌浓明显增加、摄氧率不断增大，溶氧浓度不断下降。碳源、氮源进行分解代谢：碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显减少。2．产物合成阶段（产物分泌期或发酵中期）这个阶段主要是合成抗生素。以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主，尚有合成菌体细胞物质的代谢存在，但不是主要的。由于存在抗生素合成和菌体合成两条代谢途径，外界环境的变化很容易影响这个阶段的代谢，碳源、氮源和磷酸盐等营养物质的浓度必须控制在一定的范围内，发酵条件也要严格控制，才能促使产物不断地被合成。3．菌体自溶阶段（菌体自溶期或发酵后期）菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。发酵到此期必须结束。发酵过程的三个时期：1231.停滞期2.对数期3.稳定期时间细胞数目的对数1）停滞期在刚开始接种后的一段时间，几乎未见菌体浓度的增加。工业上要求尽可能缩短延滞期，这可通过使用适当种龄的种子和接种量达到。2）对数生长期微生物在此期内的比生长速率最大，细胞数目呈指数生长。3）稳定期由于养分的消耗和微生物产物的分泌，生长速率逐渐减速直至停止。生长终止原因可能是由于某些必须养分的耗尽和自体毒性代谢物在培养基上积累的结果。在稳定期，许多次级代谢产物在此期合成，因此也称为生产期。第三节基质的影响及其控制一、碳源浓度变化及其控制（一）碳源浓度的影响1、快速利用碳源（如葡萄糖）能较迅速地参与代谢，合成菌体和产生能量，并产生分解产物（如丙酮酸等），有利于菌体生长。葡萄糖效应（关键：控制浓度，使他们不致产生抑制抗生素合成的作用）应用：常以较低的浓度和慢速利用碳源一起组成基础培养基中的混合碳源，供菌体生长用。也作为发酵过程中的中间补糖用。2.慢速利用碳源为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生索的分泌期。需要控制浓度，分批投料。（二）碳源浓度的控制补糖的数量，应使发酵液中所含的糖量能维持菌体的正常生理代谢，并能防止抗生素的生产能力衰退。一般控制法动力学模型控制法1、一般控制法：“中间补糖”法。决定补糖的参考参数有：糖的消耗速率、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液粘度、溶解氧浓度、消沫油使用情况、罐内发酵液实际体积等。开始补糖时间：根据代谢变化的情况来确定。补糖数量：以控制菌体浓度略增或不增为原则，使产生菌的代谢活动有利于抗生素的合成。补糖方式：连续滴加补入、少量多次间歇补入、大量少次补入等。2、动力学模型控制法：根据菌体比生长速率、糖比消耗速率以及抗生素比生产速率等动力学参数来控制加糖。需建立动力学模型，在实际生产上应用较少。二、氮源浓度变化及其控制1．补加有机氮源根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素等。2.补加无机氮源补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。补充方式与补碳源类似，以达到最佳生产为目标。三、磷酸盐浓度的影响与控制微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32～300mmol，但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol，提高到10mmol，就明显地抑制其合成。磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采取适当的浓度。生长亚适量的磷酸盐浓度：对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量。四、前体的影响与控制为了抑制抗生素产生菌的生物合成方向及增加抗生素产量，在一些抗生素发酵过程中加入化学前体物质。如为了提高苄青霉素的产量在青霉素发酵中加入苯乙酸等。发酵过程中加入的前体数量一次不宜太多，必须采用少量多次或者连续流加的方式加入。第四节温度的影响与控制一、温度对发酵的影响1、影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。（1）在一定范围内，随着温度的升高，酶反应速率也增加，但有一个最适温度，超过这个温度，酶的催化活力就下降。温度对菌体生长的酶反应和代谢产物合成的酶反应的影响不同。如产黄青霉菌体的最适生长温度为30℃，青霉素合成的最适温度为24.7℃。（2）温度还能改变菌种代谢产物的合成方向，影响多组分次级代谢产物的组分比例。如在高浓度Cl-和低浓度Cl-的培养基中利用金霉素链霉菌NRRLB-1287进行四环素发酵，30℃以下时合成的金霉素增多，达35℃时就只产四环素，而金霉素合成几乎停止。如黄曲霉产生的多组分黄曲霉毒素，在20℃、25℃和30℃发酵所产生的黄曲霉毒素G1与B1比例分别为3：1、1：2和1：1。2、影响发酵液的物理性质。发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等。二、影响发酵温度变化的因素产热的因素：生物热（Q生物）和搅拌热（Q搅拌）；散热的因素：蒸发热（Q蒸发）、辐射热（Q辐射）和显热（Q显）。发酵热：Q发酵[kJ／（m3．h）]Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射－Q显。1．生物热（Q生物）：产生菌在生长繁殖过程中产生的热能。生物热的大小，随菌种和培养基成分不同而变化。生物热的大小还随培养时间不同而不同。2．搅拌热（Q搅拌）：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。3．蒸发热（Q蒸发）：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，引起水分蒸发所需的热能。4．辐射热（Q辐射）：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。三、温度的控