转基因抗虫棉花检测技术规范

转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR筛查方法（试行）2编制说明为进一步加强对转基因抗虫棉花的安全监管，维护研发者、经营者和生产者的合法权益，保障人类健康和生态环境安全，根据《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理办法的规定和《关于加强转基因抗虫棉安全管理与监督检查的通知》(农办科[2005]15号)的要求，满足开展技术检测工作的需要，特制定本技术规范。1、编制原则本技术规范的编制遵循以下原则：(1)法治性：本技术规范的编制，严格执行国家法律法规和强制性标准的规定，以保证国家和研发者、经营者、生产者的权益。(2)可靠性：本技术规范的编制，力求反应相关领域研究成果的先进性、成熟性和代表性，以保证检测结果的精确性和重复性。(3)实用性：本技术规范的编制，力求把经济实用和技术实用结合起来，以保证检测的操作简便和费用低廉。(4)规范性：本技术规范的编制，力求做到技术内容叙述正确无误、文字表达简明易懂，以保证检测人员准确把握。(5)操作性：本技术规范的编制，力求将操作过程中的要点进行细化和量化，以保证检测人员操作方便。(6)兼容性：本技术规范的编制，参考和借鉴了国外同类标准或规范内容，以保证既符合国情又尽可能与国际接轨。32、编制依据本技术规范编制的法律依据主要有：(1)《农业转基因生物安全管理条例》——中华人民共和国国务院令第304号；(2)《农业转基因生物安全评价管理办法》——中华人民共和国农业部令第8号；(3)《农业转基因生物进口安全管理办法》——中华人民共和国农业部令第9号；(4)《农业转基因生物标识管理办法》——中华人民共和国农业部令第10号。3、适用范围转基因抗虫棉花可从以下三个方面进行检测：(1)筛查检测：利用通用序列分别设计引物对棉花Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac和cry1Ab的融合基因进行PCR扩增，筛查确定样品是否含有转基因成分，以判断送（抽）检样品是否为转基因抗虫棉花。(2)特异性检测：利用外源基因特异序列设计特异性引物对转基因抗虫棉花品种进行PCR扩增，检测确定样品所含外源基因类型，以判断送（抽）检样品是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。(3)品种（组合）鉴定：结合转基因抗虫棉花品种（组合）的特征、特性检测与鉴定，进一步检测或鉴定转基因抗虫棉花的品种（组4合）名称，以判断该品种（组合）是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。具体检测技术路线流程如下图所示，可根据检测工作的实际需要，选择相应的检测技术路线。转基因抗虫棉花检测技术路线流程图本技术规范规定了转基因棉花定性PCR筛查方法，适用于转基因棉花中转基因成分的定性PCR筛查。特异性检测和品种（组合）鉴定的技术规范，将根据实际情况适时予以发布。4、检测方法本技术规范包括棉花的Sad1基因和转基因抗虫棉花中的CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac与cry1Ab融合基因的定性PCR筛查方法。送（抽）检样品确定含转基因成分否确定含目标基因类型确定品种（组合）名称通用引物检测特异引物检测特征特性检测55、检测条件本技术规范实施的检测机构应具备以下条件：(1)具备PCR检测所需的仪器设备和技术人员；(2)具备相对独立的分子生物学检测实验室及其配套设施；(3)客观、公正和中立，不从事转基因棉花的研发工作；(4)承担检测的法律义务和责任，按规定对检测结果保密；(5)严格执行农业部质量检验监督中心的管理规定和检测程序。本技术规范受农业部农业转基因生物安全管理办公室委托，由农业部科技发展中心、中国农业科学院、南京农业大学、中国科学院、山东省农业科学院、吉林省农业科学院编制。编制人员：魏启文、刘信、宋贵文、沈平、汪其怀、张永军、金芜军、崔洪志、周宝良、田颖川、吴家和、路兴波、张明等。二oo五年三月6转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR筛查方法（试行）1范围本技术规范规定了转基因抗虫棉花定性PCR筛查方法。本技术规范适用于转基因抗虫棉花中转基因成分的定性PCR筛查2规范性引用文件下列文件中的条款通过本技术规范的引用而成为本技术规范的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本技术规范，然而，鼓励根据本技术规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本技术规范。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本部分。3.1Sad1基因Sad1（stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636）基因来源于陆地棉品种，该基因序列与其他植物（海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等）类似基因的序列同源性很低。Sad1基因在陆地棉基因组内含有两个拷贝。具体序列见附录A。3.2cry1Ac基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ac基因。cry1Ab基因人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ab基因。cry1Ac与cry1Ab融合基因73.3转基因抗虫棉花本技术规范中转基因抗虫棉花指含有cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因,具有对靶标昆虫具有毒杀功能的棉花。4原理针对现有转基因抗虫棉花普遍含有的棉花Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac与cry1Ab融合基因，设计这些序列的特异性引物进行PCR扩增，以筛查棉花中是否含有转基因成分。5试剂、材料及溶液配制除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.110mol/LNaOH溶液：称取氢氧化钠80g，先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。5.21mol/LTris-HCl称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa,温度为121℃,灭菌20min后贮备使用。5.3500mmol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液：称取乙二铵四乙酸二钠18.6g，加入70mL水中，再加入10mol/LNaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，用水定容到100mL。在103.4kPa，温度为121℃，灭菌20min。5.4抽提液（1000ml）药品终浓度称量样品葡萄糖0.35M69.3g1MTris-HCl（pH7.5）0.1M100ml0.5MEDTA（pH8.0）0.005M10ml聚乙烯吡咯烷酮(K30)（PVP）2%(w/v)20gDIECA（diethyldithiocarbamicacid）0.1%(w/v)1gβ-巯基乙醇0.2%（用时现加）2ml重蒸馏水定容至1000ml5.5裂解液药品终浓度称量样品8氯化钠（NaCl）1.4M81.7g0.5MEDTA（pH8.0）0.02M4ml1MTris-HCl（pH7.5）0.1M100ml十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）2%（w/v）20gPVP(K30)2%(w/v)20gDIECA0.1%(w/v)1gβ-巯基乙醇0.2%(用时现加)2ml重蒸馏水定容至1000ml5.625苯酚:24氯仿:1异戊醇（v/v）5.724氯仿:1异戊醇（v/v）5.810mg/mlRNaseA将胰RNA酶（RNaseA）溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。5.9异丙醇5.103M乙酸钠（pH5.6）将408.1g乙酸钠·H2O溶于800ml水中，用冰乙酸调pH至5.6，然后用水定容至1L，高压灭菌后备用。5.1170%乙醇5.12TE缓冲液（pH8.0）：1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和500mmol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，用水定容至1000mL。在103.4kPa,温度为121℃，灭菌20min。5.13琼脂糖5.14溴化乙锭（EB）溶液：10mg/mL。注意：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应该戴一次性手套操作。5.15四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）各2.5mmol/L的混合溶液。5.1650×TAE缓冲液：称取Tris242.2g，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL(500mmol/L)EDTA的水溶液（pH8.0），用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000mL。5.17TaqDNA聚合酶（5单位/μL）及PCR反应缓冲液。5.18DNA分子量标准。95.19加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg，加水10mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝250mg，用10mL水溶解；称取蔗糖50g，用30mL水溶解，混合三种溶液，用水定容至100mL，在4℃下保存。5.20引物。5.20.1Sad1基因。s-F:CCAAAGGAGGTGCCTGTTCAs-R:TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC预期扩增片段大小为108bp。5.20.2nos终止子序列。nos-F：5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’；nos-R：5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’；预期扩增片段大小为180bp。5.20.3CaMV35S启动子序列。35S-F：5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3'；35S-R：5'GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3'；预期扩增片段大小为195bp。5.20.4cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因序列通用引物cry1A-F：5’GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC3’；cry1A-R：5’CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT3’；预期扩增片段大小为340bp。5.21引物溶液。用TE缓冲液（pH8.0）分别将上述引物稀释到10µmol/L。5.22PCR产物回收试剂盒。按使用说明操作。5.23限制性内切酶XmnⅠ及反应缓冲液。6仪器6.1通常分子生物学实验室仪器设备。106.2PCR扩增仪。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。6.5凝胶成像系统。6.6重蒸馏水发生器。7操作步骤7.1抽样参照NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求和NY/T673转基因植物及其产品检测抽样。7.2制样参照NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求和NY/T673转基因植物及其产品检测抽样（按照GB5491中四分法制备样品进行送检）。7.3DNA模板的制备a称取200-400mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5ml离心管中。b加入1ml预冷至4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13000r/min离心机，4℃离心15min，弃去上清液。c加入600μl预热到65℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65℃的水浴锅中裂解40min。d用13000r/min离心机室温离心10min，将上清液转至另一离心管中，加入5μlRNaseA（10mg/ml），37℃水浴30min。e分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。f用13000r/min离心机室温离心10min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3M乙酸钠（pH5.6），-20℃放置2-3h，充分沉淀DNA。g13000r/min，4℃离心15min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干11DNA。加入50μlTE（pH8.0）溶解DNA。h把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。注意：I1g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200μg。IIDNA的OD260/OD280的比值应在1.8左右，且OD2