猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究1

猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究摘要猕猴桃叶介绍实验内容关键词目录第一章文献综述1.1猕猴桃叶1.1.11.1.2国内外研究现状1.2黄酮类化合物的概述1.2.11.3黄酮类物质的提取工艺研究进展1.3.11.4本文选题依据第二章实验部分2.1材料与试剂、仪器2.1.1材料2.1.2试剂与仪器2.2方法与步骤2.2.1猕猴桃叶中黄酮物质含量测定方法的建立2.2.2猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究第三章结果与分析3.1芦丁标准曲线的制作结果3.2猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺研究3.2.1最佳提取工艺的确定3.2.2最佳工艺条件的确定3.2.3猕猴桃叶中黄酮物质粗品中总黄酮得率第四章讨论4.1猕猴桃叶中黄酮物质提取工艺4.2提取工艺条件第五章结论参考文献致谢第一章文献综述1.11.2黄酮类化合物的概述黄酮类化合物（flavonoids）是指以2-苯基色原酮为基本结构衍生出来的一系列化合物。在自然界中分布比较广泛，高等植物及羊齿类植物比较多，有些苔类中也有，在与我们日常生活密切的粮食、蔬菜和水果中含量也很大。天然黄酮类化合物大多数与糖结合成苷，以苷的形式存在，也有些以游离体（苷元）形式存在。其2-苯基色原酮母体结构上通常含有一些助色团：酚羟基、甲基、异戊烯基、甲氧基等，由于这些官能团的存在，黄酮类化合物通常呈现不同的颜色，一定条件下，黄酮类物质可以与特定的试剂发生颜色反应（与酚羟基和γ-吡喃酮环有关系）。根据黄酮类化合物的结构特点，可以分为以下几种：黄酮类（flavone）和黄酮醇类（flavonol），异黄酮类（isoflavone）和二氢异黄酮类（dihydroisoflavone），二氢黄酮类（dihydroflavone）和二氢黄酮醇类（dihydroflavol），查尔酮类（chalcone）、橙酮类（aurones）、黄烷类（flavanes）、花色素类（anthocyanidins）等（姚新生2002：168）黄酮类化合物具有酸性和碱性：γ-吡喃酮环上的氧原子能与强的无机酸结合，生成性质不稳定的盐而呈现弱碱性，由于酚羟基的存在能够溶于碱性溶液呈现酸性（姚新生2002：175）.黄酮类化合物具有解肝毒、抗氧化，抗肿瘤（SteinCJandColditzGA2004）、抗炎、抗菌及抗病毒等多种生理活性。1.2.1黄酮类化合物提取方法（1）水提法适用于黄酮苷类物质的提取。优点是：成本低、安全、设备简单，适用于工业化大生产。缺点：提取率低，杂质较多（蛋白质、无机盐和糖类），后续分离麻烦，且易霉变，一般情况下不单一使用。（2）碱性水或者碱性烯醇提取法黄酮类成分大多具有酚羟基，易溶于碱水（碳酸钠、石灰水、氢氧化钠）或碱性烯醇（50%的乙醇），酸化后可沉淀析出。作用原理是碱性条件下，其苯基色原酮的1，2碳之间的碳氧键打开变成查耳酮性结构，这种结构可以溶于水，酸性条件下，查耳酮又会恢复为闭环状态。碱溶酸沉法在实际生产中用得比较广泛。石灰水浸出效果不如氢氧化钠水溶液，且有些黄酮类物质能与钙结合成不溶性物质不被溶出（李苑和张敏1999）。此法提取纯化时应注意：避免使用强碱（以免强碱在加热是破坏黄酮）、强酸（防止酸化时生成盐影响提取率）。（3）有机溶剂提取法常用的溶剂有乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮及一些极性较大的混合溶剂（如甲醇：水=1：1）。乙醇提取时常用的方法之一，因为乙醇溶解性能比较好，一般水溶液的大多数都能在乙醇中溶解。毒性小，价廉，可以回收反复使用，醇提取不易霉变。一般用90%-95%的乙醇提取苷元，60%左右的乙醇提取苷类。石油醚、乙酸乙酯等提取黄酮苷元部分。常用的提取方法有：冷浸法、渗漉法和回流法。这三种提取方法各有优缺点：冷浸法提取时间长、效率低，一般用于提取热敏性成分：渗漉法提取效率高杂质较少，但是费时长、溶剂用量大；回流效率最高，但杂质含量相对较高，含有受热易被破坏成分的药材不适用。（4）超声提取法超声波提取技术是利用超声波的空化效应加速有效成分的浸出，能效低，效率高，不破坏有效成分。空化效应、热效应和机械作用是超声技术在中药提取中的三大理论依据（王昌利等1993）。（5）微波辅助萃取法（microwaveassistedextraction,MAE）微波辅助萃取是利用物质吸收微波能力的差异，选择性加热，从而是被提取物质分离进入提取剂中（王艳和张铁军2005）。而且微波产生的电磁场可以加速被萃取成分向萃取溶液界面扩散，使有效成分在相对较低的温度下以最快的速度被萃取，从而最大限度的保证萃取的质量。选择性高、易控制、得率高、无污染（李巧玲2003）。（6）酶解法传统的溶剂提取法是利用提取溶剂中有效成分的浓度梯度，通过扩散作用促使被提取成分逐渐分散到提取试剂中达到分离的目的。但是由于植物细胞壁中纤维组织的阻碍，往往提取时间长，溶剂用量大，效率大。近几年，研究者利用纤维素酶、果胶酶等分解细胞壁及细胞间的纤维素和果胶，迫使细胞壁软化甚至崩溃，从而改变细胞壁的通透性，减少有效成分溶出的阻力，提高提取率，降低提取成本。（7）双水相萃取分离法双水相萃取是依据物质在两相间的选择性分配，提取有效成分。在双水相体系中，由于表面性质、电荷作用和各种力（氢键和离子键等）的存在，物质在两相间中的浓度不同。针对被分离的物质，研究者选择合适的体系，控制适当的条件就可以达到分离的目的（徐长波和王巍杰2009）。与传统溶剂法相比较，提取过程中不使用有毒、易燃的有机溶剂，生产环境安全，也降低了有效成分变性的几率。这种方法在蛋白质的分类提取中使用的比较多，黄酮类物质的分离纯化中使用的相对较少。（8）超临界流体萃取技术（SFE）SFE是通过超临界流体的溶解能力与密度（与液体相近）的关系进行提取的。超临界性质特殊，其渗透性和溶解能力较好。通过调节提取温度和压力可以控制其溶解力，进行有效性的溶解，然后改变提取压力和温度，获得目标提取物（葛云初和黎阳2009）。最常用的超临界流体为CO₂，CO₂性质稳定，无毒，便宜易得，临界压力不高。由于CO₂是非极性的，所以根据相似相容原理对极性较大的物质的溶解能了必然不够，因此实际操作中通常加入另外的物质来改变CO₂的极性，提高溶解能力。CO₂-SPE技术提取分离黄酮类化合物和传统方法比较，最大的优点是产品中没有残留的有机溶剂。（9）其他大孔吸附树脂在中药的提取中应用也较多，是传统中药制剂质量控制和现代化的有效手段，改善了我国传统中药药丸“黑、大、粗”的外观形象，操作简单，污染小。此外，还有半仿生提取和膜提取等方法。1.4本文选题依据中华猕猴桃是我国特有的藤本果种，属于猕猴桃科猕猴桃属，陕西省西安市周至县和毗邻的宝鸡市眉县盛产猕猴桃。中华猕猴桃果实营养丰富，被誉为维C之王，另外还有显著的药效作用，其枝、叶、根、藤都是很好的中药材。随着消费水平的提高，人们越来越注重提高生活质量，保健食品日益受到人们的关注。在众多的天然活性成分中黄酮类化合物是极有应用潜力的资源之一。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，因此近年来各国科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等特异功能的保健食品。目前对猕猴桃的果实和根都有较深的研究，然而却鲜有对猕猴桃叶化学活性成分的研究。长期以来，猕猴桃叶只是被直接用作田间肥料，动物饲料或直接焚烧。为了充分利用每年产生的大量猕猴桃叶，同时避免由此而造成的环境污染，本项目将通过对中华猕猴桃叶中化学成分的初步分析，研究中华猕猴桃叶中黄酮类物质的提取工艺，以期为猕猴桃叶的进一步开发利用提供方法参考，对猕猴桃叶资源的综合利用和医疗保健有积极作用。第二章实验部分2.1材料与试剂、仪器2.1.1材料2.1.1.1猕猴桃叶2009年10月采自杨凌北边的猕猴桃园，为绿色并伴有微黄。将其用清水漂洗，除去材料中的泥沙，木枝等杂质。洗净后阴干，粉碎备用。2.1.1.2大孔树脂（D-101）将大孔吸附树脂先用蒸馏水搅拌清除杂质，将蒸馏水濞出，加酒精（6：4）搅拌浸泡48h。2.1.2仪器与试剂Xxx型紫外可见分光光度计（xxx分析仪器总厂）；xxx型电子天平（xx光学仪器厂）；离心机；所有试剂都是国产分析纯。2.2方法与步骤2.2.1．用大孔吸附树脂吸附洗脱黄酮1将活化的大孔树脂进行装柱，离柱上端留10cm空柱。2装好柱后，将离心得到的澄清液加入柱中（树脂颗粒是棕色），加完后，流出的黄色溶液可作50%乙醇液洗涤时用（约80ml），使之充分吸附3．分别用蒸馏水，10%乙醇溶液，20%乙醇溶液，30%，40%，50%，60%，70%乙醇溶液各200ml洗脱树脂柱，前三组洗出液为浅黄色。收集后5组流脱液，从第4组开始，洗脱液变深黄发微红色，洗至70%乙醇液时，洗脱液基本只略带黄色，用完70%乙醇液停止洗涤。收集洗脱液约950ml，共用时6.5h2.2.2浓缩洗脱液1.浓缩洗脱液在60℃下，用旋转薄膜蒸发仪浓缩洗脱液950ml浓缩至约15ml浓缩液为褐红色，冷却后有混浊，共用时4.5h2.将浓缩液放入玻璃皿中干燥玻璃皿洗净干燥1h，称量m0=35.157g浓缩液干燥后+玻璃皿m1=36.0180g得m=0.8608g产率η1=0.8608/（10.04+10.05）×100%=4.2826%工艺的评价1．实验提取时间长，提取充分。2．提取所涉及方法步骤简单，易操作。3．分离所用树脂不易选取，需做独立实验专门选择适当的大孔树脂。4．分离效果不好，产物（干燥）泛红，嗅有微甜，含有糖类物质。2.2.3猕猴桃叶中总黄酮的提取工艺（二）酮类萃取法1.稀丙酮提取。用7.5倍切碎干净液重的60%丙酮，在58℃下回流浸渍二次，每次30min，合并2次滤液，减压回收丙酮至固形物为30%~40%，丙酮含量＜5%，向其中加入2倍水稀释，搅拌，冷却（12℃）。2.丁酮：丙酮（6:4）萃取上清液加入（NH4）2SO4，再加丁酮：丙酮混合试剂萃取2次，合并萃取液，分离水相和有机相（Ⅰ）3.丁醇，环己烷萃取上述水相加水稀释，再加丁酮萃取，得有机相（Ⅱ），弃去水相。有机相（Ⅰ）加压浓缩，回收溶剂至固形物为50%~70%，加水稀释至固形物为10%，再用丁醇萃取，弃去水相，得有机相（Ⅲ）。合并有机相（Ⅱ，Ⅲ），减压浓缩，再用水和乙醇（95%）稀释至乙醇含量为50%，固形物10%，以环己烷萃取，弃去环己烷相，水相减压浓缩，60~80℃下干燥。4.稀丙酮提取1.称取猕猴桃叶10.26g，10.34g两组，分装两个烧瓶中。2.量取60%丙酮80ml，在58℃下回流浸提2次，每次半小时，合并两次滤液（绿色）3对两次液体减压浓缩，出现固形物质。4对浓缩后的溶液加水稀释，搅拌，在12的水浴锅中静置1h，离心（4000r/min）半小时，取上清液。丁酮：丙酮萃取1.取上清液于烧杯中，加入足量（NH4）2SO4，使溶液达到饱和。2.转入分液漏斗中，加入丁酮：丙酮（6:4）混合溶剂萃取2次。分液漏斗内，上层为红色有机相（Ⅰ），下层为黄色水相。3.将上述水相与有机相分离，水相加水稀释，加正丁酮萃取，得有机相（Ⅱ），上述有机相（Ⅰ）减压浓缩至固形物为50%左右，加五倍量蒸馏水稀释，再用丁醇萃取，得有机相（Ⅲ）。4.合并有机相（Ⅱ，Ⅲ），减压浓缩，用水和乙醇（95%，1:1配比）溶液，稀释浓缩液是固形物约为10%，以环己烷萃取，上层为乳白色混浊，下层为黄色澄清液，取水相减压浓缩，60℃干燥得黄色产物。玻璃皿重：34.2861g玻璃皿+产物：34.5556g产物：η=0.2695/（10.26+10.34）×100%=1.308%