第二章发酵过程的工艺控制-1

第二部分发酵工艺控制第二章发酵过程的工艺控制第三章基因工程菌的发酵第四章动植物细胞培养第二章发酵过程的工艺控制2.1概述2.2基质浓度对发酵的影响及其控制2.3灭菌情况2.4种子质量的影响2.5温度对发酵的影响及其控制2.6pH对发酵的影响及其控制2.7溶氧对发酵的影响及其控制2.8二氧化碳和呼吸商2.9补料对发酵的影响及其控制2.10泡沫对发酵的影响及其控制2.11发酵终点的判断2.12发酵染菌的防治2.1概述一.发酵体系的主要特征1.细胞内部结构和代谢反应的复杂性2.细胞所处环境的复杂性3.过程系统状态的时变性及参数的多样性和复杂性影响因素多，有的因素未知，主要影响因素变化。发酵水平主要取决于：生产菌种的特性；对工艺条件的控制（适合程度）；必须了解：●菌体的生理代谢规律●工艺条件对发酵过程的影响及其控制●发酵过程的有关变化规律常规发酵的工艺控制参数：温度、pH、搅拌转速与功率、空气流量、罐压、液位、补料速率及补料量等。二.发酵过程的参数检测1.直接状态参数●指能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数●包括：pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度、基质和产物浓度、菌体浓度（OD、DCW、湿重）等●参数的检测a在线检测各种传感器：pH电极、DO电极、温度电极、液位电极、泡沫电极尾气分析仪：测尾气O2和CO2含量b离线检测分光光度计、pH计、温度计、气相色谱（GC)、液相色谱（HPLC)、色质连用（GC-MS)等2.间接状态参数●指利用直接状态参数计算求得的参数●包括：比生长速率μ、摄氧率OUR、CO2释放率CER、呼吸商RQ、氧的得率系数YX/O、氧体积传质系数KLa、基质比消耗速率QS、产物比生成速率Qp等综合各种状态参数，获得代谢过程的各种信息，从而对发酵过程做出相应的调整和控制，以获得最经济的发酵生产。三.发酵过程的代谢调控和优化1.代谢调控以代谢（流）的调节最重要●调节酶的合成量，称为“粗调”●调节酶的催化活性，称为“细调”代谢工程工艺控制和过程优化的实质，就是利用各种方法和手段，使细胞的外部和内部环境最适合基质和能量流向产物合成的生物途径，以获得最大的产量。2.发酵过程优化的一般步骤●确定反映发酵过程的各种理化参数及其检测方法●研究这些参数的变化对发酵过程的影响及其机制，获得最佳的范围和最适的水平●建立数学模型定量描述个参数间随时间的变化关系，为过程优化控制提供依据●通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程的最优控制2.2基质浓度对发酵的影响及其控制先进的培养基组成是充分支持高产、稳产和经济的发酵过程的关键因素之一。一.基质种类一般包括：碳源、氮源和无机盐前体二.基质（原料）的质量随产地和生产工艺而异须保证稳定的原料质量尤其对有机碳源和氮源，经多次实验而定三.基质浓度对发酵的影响每一种基质都有一个适宜的浓度范围●基质浓度太低影响细胞的生长，不能保证足够量的菌体进行生产；延长发酵时间，降低生产效率●基质浓度太高菌体生长太旺盛，发酵液黏度很大，KLa很小，DO很低，影响发酵正常进行；影响产物形成：如酵母利用葡萄糖进行培养，葡萄糖浓度太高，将进行无氧发酵，产生乙醇，即为crabtree效应又如葡萄糖氧化酶（GOD)发酵中：◆低浓度下：诱导作用◆高浓度下：分解代谢物阻遏作用浓度由8%→6%，酶活提高26%以铵盐为氮源发酵：NH4+浓度过高，产生铵离子效应，影响生长和合成●基质浓度的控制◆初始培养基中：基质浓度适宜（由实验而定）◆发酵过程：通过补料操作来控制基质浓度应根据菌体特性、工艺条件要求和发酵过程中代谢的具体情况，确定补料方式、速率和补料量。0300060009000016487296120Time(h)TiterofCTC(u/ml)0.30.81.31.82.32.83.33.84.3Conc.ofNH2-N(g/L)CTC2g/LCTC4g/LCTC6g/LCTC8g/LCTC10g/LNH2-N2g/LNH2-N4g/LNH2-N6g/LNH2-N8g/LNH2-N10g/LEffectof（NH4）2SO4onCTCBiosynthesis(摇瓶)0200040006000800018426690120t（h）CTC（u/ml）353739414345X（10g/L）CTC0.043g/LCTC0.087g/LCTC0.13g/LCTC0.195g/LX0.043g/LX0.087g/LX0.13g/LX0.195g/LEffectofKH2PO4onCTCBiosynthesis0300060009000018407090120Time(h)TiterofCTC(u/ml)00.30.60.91.21.51.8Conc.ofNH2-N(g/L)CTC10g/LCTC20g/LCTC29g/LCTC40g/LCTC50g/LNH2-N10g/LNH2-N20g/LNH2-N29g/LNH2-N40g/LNH2-N50g/LEffectofsoybeanflouronCTCBiosynthesis030006000900024487296120Time(h)TiterofCTC(u/ml)00.20.40.60.811.21.41.6Conc.ofNH2-N(g/l)CTC1g/LCTC3g/LCTC5g/LCTCControlNH2-N1g/LNH2-N3g/LNH2-N5g/LNH2-NControlEffectofyeastextractonCTCBiosynthesis03000600090001200015000180002100016406488112t（h）CTC（u/ml）20304050607080X（*10,g/l）OUR（mmol/h/l）CTC0.05‰CTC0.15‰X0.05‰X0.15‰OUR0.05‰OUR0.15‰TheeffectofKH2PO4onCTCfermentation（发酵罐）010203040506082542567390104121t(h)CER(mmol/l/h)040008000120001600020000Conc.ofCTC(µg/ml)CER1#CER2#CER3#CTC1#CTC2#CTC3#TheeffectofdifferentkindsofyeastflouronCTCfermentation010203040506018426690114t(h)Conc.ofbiomass(g/l，*10)0500010000150002000025000Conc.ofCTC(µg/ml)X0.0028X0.0042X0.0056CTC0.0028CTC0.0042CTC0.0056Effectofdifferentconc.ofyeastextractonCTCfermentation2.3灭菌情况灭菌温度高，时间长，对培养基破坏作用越大，影响菌体生长和产物合成。如葡萄糖氧化酶（GOD)发酵中，灭菌温度比灭菌时间对产酶的影响更大。一些易被高温破坏的成分如葡萄糖、前体等应该分消。2.4种子质量的影响种子的质和量对菌种生长的快慢和产物的合成存在重要的影响。1.接种菌龄●菌龄指在种子罐中培养的菌体从开始培养至接种到下一级种子罐或发酵罐的这段培养时间●适宜菌龄以对数生长期的后期，即培养液中菌浓接近高峰时的种子较适宜●菌龄过小发酵前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟●菌龄过大菌量较多，生产能力下降，菌体过早自溶最适的菌龄须多次实验，由发酵的结果而定0102030405062441557289103120t(h)CER(mmol/l/h)040008000120001600020000Conc.ofCTC(µg/ml)CER18.5CER20.6CER23.3CTC18.5CTC20.6CTC23.3TheeffectofinoculumageonCTCfermentation（罐）2.接种量●接种量指接（移）种的种子液体积与培养液体积之比●适宜的接种量与菌体的特性（生长繁殖速度）及发酵工艺有关常用接种量：5%~10%抗生素生产：20%~25%，甚至更大较大的接种量：可缩短生长达到高峰的时间，使产物合成提前，减少杂菌生长的机会●接种量太小生长延迟期延长，发酵周期长，产物形成较迟生产效率降低●接种量过太生长过快发酵液黏度增加溶氧不足影响产物合成2030405060163047647895112t/hConc.ofX（g/l，*10）10004000700010000130001600019000Conc.ofCTC（µg/ml）X(%)10.40%X(%)14.00%X(%)17.30%CTC10.40%CTC14.00%CTC17.30%TheeffectofinoculumamountoncellgrowthandCTCbiosynthesis010203040506062340547188102118t（h）CER（mmol/l/h）10.40%14.00%17.30%TheeffectofinoculumamountonCER2.5温度对发酵的影响及其控制菌体生长和产物合成都是在各种酶的催化下完成的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中维持稳定而合适的温度就显得十分重要。一影响发酵温度的因素1发酵热●发酵热是指发酵过程中释放的净热量，Q发酵[J/(m3·h)]●Q发酵=Q生物+Q搅拌－Q蒸发－Q显－Q辐射◆生物热Q生物菌体在生长繁殖过程中产生大量的热称为生物热由生物大分子（碳水化合物、脂肪、蛋白质）分解为小分子（CO2、NH3、H2O等）而产生的；一部分用于合成高能化合物、菌体合成、维持代谢、产物合成，其余以热的形式释放出来；◆搅拌热Q搅拌好气培养中由于搅拌作用而产生的热量◆蒸发热Q蒸发和显热Q显由于发酵液中水分的蒸发带走的热量为Q蒸发由尾气的排出带走的热量为显热◆辐射热Q辐射由于罐内外温差，发酵液中通过罐体向外辐射的热量抗生素生产的最大发酵热：3000~7000×4.19kJ/(m3·h)为了维持一定的温度，须采取相应的措施：在蛇管或夹套内，通入冷却水（或热水）进行冷却（或加热）。2影响生物热的因素培养基成分越丰富菌体对基质的利用速率越大生物热越大发酵过程中代谢越旺盛抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号，说明抗生素合成时菌体的代谢十分旺盛生物热与呼吸强度存在对应关系二温度对菌体生长的影响最适生长温度和耐受范围各异，跨度一般为30℃1温度对菌体生长的影响●温度对菌体生长和死亡的影响菌体的生长速率：dX/dt=μX－αX(2-1)式中μ为比生长速率，α为比死亡速率温度对μ和α的影响可以用Arrennius方程表示：lnμ=lnA－Ea/RT(2-2)lnα=lnA'－E'a/RT(2-3)式中A和Ea分别为Arrennius常数和活化能，R和T分别为通用气体常数和绝对温度典型活化能Ea：50~70kJ/mol死亡活化能E'a：300~380kJ/mol若发酵温度从T1提高至T2（温差△T=T2－T1），菌体的μ的变化可由式(2-2)得：ln（μ1/μ2）=－Ea/R（1/T1－1/T2）=－（Ea/R）×△T/（T1T2）(2-4)同样可得：ln（α1/α2）=－（E'a/R）×△T/（T1T2）(2-5)由于E'a＞Ea，因此比死亡速率α的变化大于比生长速率μ的变化，即温度对具有高活化能的死亡速率的影响远大于具有较低活化能的生长速率；菌体的生长必须保持在一定的温度范围，若超过这个范围，菌体就生长不好，甚至无法生长又如青霉素发酵中：生长的Ea=34kJ/mol合成的Ea=112kJ/mol说明青霉素合成速率对温度更敏感，可以采用变温发酵来提高青霉素的合成；●温度对得率系数YX/S的影响在酵母的培养中：温度上升，得率系数YX/S随之下降维持所需的能量增加维持活化能：50~70kJ/molT最大转化率略低于T最适生长●温度对细胞代谢的影响温度升高，μ增大，生物大分