酶解法制作排骨汤的工艺条件优化

酶解法制作排骨汤的工艺条件优化李泱，王清章*，张亮，王琳华中农业大学，武汉（430070）E-mail：[e-mail]摘要：采用风味蛋白酶酶解法制作排骨汤，通过单因素和正交实验对其工艺条件进行优化。结果表明，水解度为30%时排骨汤的感官品质最好。酶解法制作排骨汤的最佳工艺条件为：温度为50℃，pH值为7.0，水解时间3h，加酶量为0.4%，风味良好，无任何苦味和异味。关键词：风味蛋白酶；酶解；排骨汤；水解度排骨富含多种人体必需氨基酸,可提供人体所必需氨基酸、矿物质、维生素[1]，是居民日常饮食中蛋白质主要来源之一。排骨汤是将排骨调味后煲制而成的一种中国传统营养美食，其营养丰富、风味独特，从而受到广大消费者的喜爱。但目前排骨汤的制作主要是家庭凭经验煲制，存在耗时长、保质期短、风味差异大等问题。从而对于生活节奏越来越快的现在社会家庭来说，限制了其对排骨汤的消费。开发风味优良、质量稳定的排骨汤制品，可填补市场空白、满足消费需求。酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。风味蛋白酶是一种具有蛋白外切酶活力的复合酶，外切肽酶的添加可使蛋白水解液呈现鲜美的滋味。利用风味酶蛋白酶解猪排骨制作排骨汤，不仅可以提高排骨中氨基酸的利用率和吸收率，而且也可以改善排骨汤的风味。与已有的生产方法相比,酶解法有很多优点,因此对酶法生产动物蛋白质水解液的研究很受重视[2]。但蛋白质过度的水解会产生苦味等不良的滋味，不仅影响排骨汤的风味，而且造成生产成本提高。因此，本文为工业化生产方便排骨汤制品提供理论依据。1.材料与方法1.1实验原料新鲜排骨，购于华中农业大学中百超市。分割成小块后，自来水漂洗干净，沥干表面水分并分装(150g/袋)，-18℃冰箱冷冻贮藏备用。风味蛋白酶，诺维信天津公司，酶活23000U/g(使用时测定)。1.2主要实验方法1.2.1排骨汤的酶解法制作工艺工艺流程：排骨→解冻→清洗→调pH→酶解→灭酶→冷却→排骨汤工艺要点：称取一定量解冻的清洗排骨后称取若干份，按料液比(1:4)加入pH缓冲液，于恒温水浴锅中加热至设定的酶解温度。在不同的酶解温度(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)、pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、底物浓度(2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%)、加酶量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)、酶解时间(1h、2h、3h、4h、5h)下酶解。酶解结束后，立即沸水浴10min，自然冷却至室温，即得排骨汤。1.2.2水解度的测定[3]取一定量排骨汤汤汁，于4℃、4000r/min条件下离心20min并收集上清液，测定其水解度。水解度的计算方法如下：原料总氮量水解液中氨基态氮含量水解度=其中，粗蛋白质含量测定：微量凯氏定氮法[4]；氨基氮的测定：中性甲醛两步滴定法[5]。1.2.3感官鉴评的方法选取经培训过的实验人员5人，分别对水解液的外观（色泽、澄清度）、风味（肉香味、鲜味）和口感（甜味、涩味、苦味）进行评定，各项满分100分。总分权重分布为外观20%、风味60%和口感20%[6]。1.3正交实验设计表1正交实验设计表因素水平A(温度/℃)B(pH)C(时间/h)D(加酶量/%)1406.020.12456.530.23507.040.34557.550.42.结果与分析2.1水解度对排骨汤风味的影响蛋白质的水解程度对排骨汤的风味产生影响，适当的水解可以增强汤汁的风味，过度水解则会产生苦味及涩味等不良的风味。因此，控制蛋白质的水解程度对排骨汤的酶法制作有重要意义[7]。不同酶解程度对排骨汤风味的影响见图1。图1水解度对排骨汤风味的影响(反应温度为50℃，PH值7.0，料液比为1:4)从图1中可以看出，排骨汤的风味随着猪肉蛋白水解程度的增加而呈现先增加后减少的趋势。当猪肉蛋白的水解度达到30左右时，排骨汤的风味最佳。继续水解时，一些呈苦味的疏水性氨基酸残基或其形成小肽游离出来，虽然风味蛋白酶的外切酶能力可以有效的减少苦味物质的生成，但苦味物的阈值很低，影响排骨汤的风味。因此，酶解时的水解度应控制在30左右。2.2酶解温度对排骨汤水解度的影响酶解温度直接影响蛋白酶的催化反应速率及其稳定性。酶解温度对排骨汤水解度的影响见图2。02468101214162.55.310.015.827.630.235.4水解度(%)感官评价酶解温度对水解度的影响(料液比为1:4，ph值7.0，加酶量0.4%，酶解时间3h)从图2可知，随着反应温度的增加水解度呈现先增加后下降的趋势。45~55℃时，猪肉蛋白适度变形，有利于折叠结构的舒展，肽键更易与酶结合，酶解速度加快，水解度增高，其中50℃水解度最高，是最适酶解温度。温度继续升高时，酶蛋白逐渐变性，酶解效率也随之降低。风味蛋白酶酶解液在75℃以上保持10min，可使酶结构发生变化，达到不可逆失活的效果。2.3pH对排骨汤水解度的影响pH对酶催化反应的影响包括三个方面，即影响酶的稳定性，酶催化底物转变成产物的能力，以及pH对底物中结合部位解离状态的影响。不同pH下排骨汤的水解度见图3。从图3中可以看出，pH7.0以下时，水解度随着pH升高而升高，当pH继续升高时，酶的稳定性下降，酶活降低，水解度随之下降。蛋白质酶解过程具有由碱性至酸性的特点，所以维持pH稳定，对酶解反应的控制与优化是至关重要。实验结果表明，pH7.0是最适条件。图3pH对水解度的影响(料液比1:4，温度为50℃，加酶量0.4%，酶解时间3h)051015202530354045505560温度(℃)水解度(%)051015202530355.05.56.06.57.07.58.0pH水解度(%)底物浓度对水解度的影响(酶解温度50℃，ph值7.0，加酶量0.4%，酶解时间3h)底物浓度对于反应的速率起着重要的作用。原料加水少，水解不彻底，蛋白质提取率低；加水多，有助于水解反应进行，提高了蛋白质提取率。实际生产中，排骨汤要保持一定的浓度，否则影响风味。不同底物浓度下排骨汤的水解度见图4。由图4可知，底物浓度越小越有利于酶解。因为反应在水溶液中进行，水有利于分子的扩散和运动，底物浓度过高，使水的有效浓度降低，反应速度下降[8]。但在实际生产中，考虑排骨汤的感官风味，因而在保证一定水解度的情况下，选用底物浓度为4%。2.5加酶量对排骨汤水解度的影响图5加酶量对水解度的影响(酶解温度50℃，ph值7.0，底物浓度为4%，酶解时间3h)不同加酶量下排骨汤的水解度见图5。从图5可以看出，随着酶用量的增加，水解度呈现增加趋势。酶用量大于0.4%时，水解度增加值减少。酶用量越大，生产成本相应提高，同时，也有可能导致酶自身相互水解而降低酶活。酶用量0.4%时，排骨汤的水解度接近28，风味较好，因此选择0.4%为最适加酶量。0510152025300.20.40.60.811.21.4底物浓度(%)水解度(%)0510152025303500.10.20.30.40.50.6加酶量(%)水解度(%)酶解时间对水解度的影响(酶解温度50℃，ph值7.0，底物浓度为4%，加酶量0.4%)酶解时间对排骨汤水解度影响见图6。从图6可知，随着酶解时间的延长水解度逐渐增大，且在最初水解的3小时内显著提高，此后增加缓慢。水解3h时，排骨汤的水解度接近28，为最佳水解时间。2.7正交实验结果经过单因素试验，可以得到风味蛋白酶酶解的最佳温度为50℃、最佳pH为7.0，最佳酶解时间为3h，最佳加酶量为0.4%，最佳反应时间为3小时，确定每个因素的最佳使用区域，再进行正交试验。实验设计方案及结果见表2，A为温度(℃)，B为pH值，C为时间(h)，D为加酶量(%)。方差分析结果见表3。表2L16（44）正交实验结果试验号A，温度(℃)B，pHC，时间(h)D，加酶量(%)水解度(%)1406.020.127.82406.530.228.43407.040.328.14407.550.428.45456.030.327.06456.520.427.77457.050.130.78457.540.231.89506.040.427.110506.550.328.611507.020.231.912507.530.133.713556.050.229.514556.540.131.415557.030.430.416557.520.332.7F/α730.6/0.011281.8/0.0149.0/0.00636.8/0.01051015202530354012345时间(h)水解度(%)均值分析结果温度(℃)pH时间(h)加酶量(%)404550556.06.57.07.523450.10.20.30.4水解度(%)28.2d29.3c30.3b31.0a27.9d29.0c30.3b31.7a30.0a29.9a29.6b29.3c30.9a30.4b29.1c28.4d从方差分析表3中可知，各因素对解度的影响均达到极显著水平，且各因素的影响次序为B＞A＞D＞C，即pH值的影响最大，时间影响最小。在50℃、pH7.0条件下添加0.4%的风味蛋白酶水解3h，此时排骨汤的水解度最接近30%，感官风味最好，是最佳工艺条件。3.小结（1）利用风味蛋白酶对排骨进行水解，可以显著的提高排骨的风味，所得水解汤液风味较佳，在一定的酶解条件下无苦味和异味，可用于排骨罐头的工业化生产。（2）经过单因素实验和正交实验，确定酶解最佳工艺条件为：温度为50℃，pH值为7.5，水解时间3h，加酶量为0.4%。在酶解过程中加酶量对酶解效果的影响最大，时间的影响次之，温度影响较小，pH值影响最小。参考文献1.Watt,B.K.,andA.L.Merrill.compositionoffeeds-raw,processed,prepared.FoodsAgric.Handbook.ConsumerandFoodEconomicsResearchDivision,Agric.Res.,U.S.A.Washington,D.C.1963.No.82.朱新生,丁霄霖,刘立国.热反应肉类香精反应底物猪肉酶解物制备的研究[J].中国调味品,2005(1):7-123.赵淮新,冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学,1994(11):65-67．4.食品分析.大连轻工业学院.[M].北京:中国轻工业出版社,1994.5.蔡武城,袁厚积.生物物质常用化学分析方法[M].北京:科学出版社,1982.6.林娈．文蛤肉酶解工艺研究[D]．福州：福建农林大学.2006,7.刘晓艳，成坚．酶解方法对鸡肉风味的影响．食品工业科技，2002(2)：82-828.张永秀，王世平，周若兰．Flavourzyme蛋白酶酶解牛骨制备低聚肽的处理条件研究[J]．食品工业科技，2006(07）：141-143OptimizetheprocessconditionofchopsoupwithenzymeLiYang，WangQingzhang，ZhangLiang，WangLinHuazhongAgriculturalUniversityCollegeoffoodscienceandtechnology，Wuhan(430070)AbstractThisstudyutilizedFlavorzymetomakechopsoup,optimizingtheprocessthroughsinglefactorsandorthog