第八章培养基灭菌及发酵设备

第八章培养基灭菌及发酵设备一培养基灭菌及灭菌设备培养基灭菌的目的：保证所选用的培养基没有受到其它杂菌的污染染菌产生的不良后果？灭菌的方法有：化学药剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌培养基的灭菌方式：1.湿热灭菌：2.过滤除菌3.微波灭菌1.湿热灭菌法是利用水蒸气的热量将物品灭菌。水蒸气具有穿透能力强，易于传导热量的优点。湿热更容易将微生物细胞中蛋白质的氢键打断，使其发生变性凝固。优点：经济、快速不同微生物菌株，所需湿热灭菌的温度和时间不一样。多数细菌和真菌营养体在60℃左右，5-10min死亡；真菌和酵母菌的孢子，80℃以上才会死亡；嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在121℃,12min才能死亡常见的湿热灭菌有以下几种：1）常规加压灭菌法因无法了解待灭菌培养基中微生物的热致死特性，常假设杂菌是嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；灭菌工艺是0.1MPa，维持15-30min(灭菌是靠温度）2）连续灭菌法3）巴斯德消毒法一般60-80℃,15s-30min;现在超高温巴斯德灭菌法，140℃,3-4s，急剧冷却至75℃4）间歇灭菌法：80-100℃,15-60min,室温过夜，重复三次2.过滤除菌法含有酶、血清、维生素、氨基酸等容易热失活的培养基，可以采用此法。过滤介质有膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚丙烯腈等深层过滤材料：石棉板、烧结陶瓷、烧结金属等过滤器主要有两类：绝对过滤器：过滤介质呈膜状，滤孔比要除去的颗粒直径小，理论上可以完全除去微生物。去除机制为拦截作用。另一类是深层过滤器：空隙的直径比要除去颗粒的直径大，由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维组成。工作机制是通过惯性碰撞、扩散和吸附作用除菌。过滤介质有两类：一类是棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，要填充在一定的容器中定形；一类是已制成板状或管状，如石棉板和烧结材料等。实验室常用的滤器孔径是0.45微米和0.22微米。3.微波灭菌法主要是利用微波（300MHz~3000GHz的电磁波，是无线电波中一个有限频带的简称，即波长在0.1毫米~1米之间的电磁波）的热效应微生物在微波电磁场的作用下，吸收微波的能量，产生热效应，同时微波造成分子的加速运动使细胞内部受到损害，从而导致微生物死亡。特点：加热均匀、热能利用率高，穿透能力强，加热时间短。主要内容一、空罐灭菌二、灭菌有关理论三、分批灭菌四、连续灭菌一、空罐灭菌1、目的：1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物3）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染2、步骤：（热蒸汽法）1）先彻底清洗作用：a）有利于消除死角b）免于料受热（尤其是干热的部位）干焦于罐体、管或阀门2）从底部通入蒸汽3）排冷气4）升压打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如接种管、取样管、空气进管、流量计等）5）保压通常1kg/cm2,30～60min6)降温关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气；或自然冷却，或泵循环水加速冷却Notes:a）确保无死角产生b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法c）勿激碎视镜二、培养基灭菌的有关理论一）加热灭菌原理1、微生物的热阻每一种微生物都有一定的生长温度范围；当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。微生物相对热阻细菌和酵母的营养细胞1细菌芽孢3×106霉菌孢子2-10病毒及噬菌体1-5某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为热阻（heatresistance）。下面介绍与热阻相关的几个概念1）致死温度（Deathtemperature）——杀死微生物的极限温度称为致死温度。2）热力致死时间(ThermalDeathTime;TDT)——在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。e.g伤寒杆菌58℃30min变形杆菌55℃60min3）D值------利用一定温度进行加热,90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。DD=10min0102030405060加热时间(min)10510410310210106残存活细胞数残存活细胞曲线例：含有某种细菌的悬液，含菌数为105/ml,在100℃（212°F）的水浴温度中，活菌数降低到104/ml时所需的时间为10min,则该菌的D值即为10min。D100=10min如果加热的温度为121℃，则常写成Dr4）Z值——在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%所需升高的温度，即为Z值。10011510010加热时间（min)加热温度（℃）加热致死时间曲线ZZ=152、微生物的热死规律——对数残留定律◇微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。◇微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。◇在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。对数残留定律的概念：数学表达式：-dN/d=NN——培养基中活的微生物个数；——时间（s）;——比死亡速率（s-1）(死亡速率常数)dN/d——微生物的瞬间变化率，即死亡速率——对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。若开始灭菌（=0）时，培养基中活的微生物数为N0=2.303logN0/N/-dN/d=NlnN/N0=-积分2.303logN0/N=or=2.303lgN0/N/可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和值◆在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。◆灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N=0，则为∞，上式无意义，事实上也不可能。一般取N=0.001，即1000次灭菌中有1次失败。例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)N=0.001;=1.8(min－1)=2.303lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)3、死亡速率常数（比死亡速率）◆死亡速率常数是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。◆相同温度下，值越小，则此微生物越耐热。在121℃，细菌芽孢的值约为1min-1,而营养细胞的值为10-1010min-1。细菌芽孢名称值min-1枯草芽孢杆菌FS5230硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518硬脂嗜热芽孢杆菌FS617产气梭状芽孢杆菌PA36793.8-2.60.772.91.8121℃某些细菌芽孢的值4、培养基灭菌温度的选择◆培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。◆培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。◆灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。◆在其它条件不变时，比死亡速率与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。SvanteAugustArrheniuswasaSwedishphysicalchemistbestknownforhistheorythatelectrolytes,certainsubstancesthatdissolveinwatertoyieldasolutionthatconductselectricity,areseparated,ordissociated,intoelectricallychargedparticles,orions,evenwhenthereisnocurrentflowingthroughthesolution.In1903hewasawardedtheNobelPrizeforChemistry.=AeRTE－—ArrheniusequationA—比例常数；E—杀死细菌所需的活化能，(E)（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)=AeRTE－—lg=———+lgA－E2.303RT以lg对1/T作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为lgA，从斜率和截距科求得A和E值。1/Tlg截距=lgA斜率=－E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：-dC/d=′CC—对热不稳定物质的浓度,(mol/L);′—分解速率常数（s－1）；—分解反应时间（s）′随反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，′和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程表示：′=A′eRTE′－—A′—比例常数；E′—分解活化能，(E′)（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)1=AeRT1E－—2=Ae－—ERT2相除取对数ln21=E11RT1T2－〔〕在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数′都变化。温度由T1升高到T2，值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln2′1′=〔〕RT1T2E′11ln(2/1)ln(2′/1′)＝EE′上面两式相除，得由于灭菌的E大于培养基成分分解的E′名称E(J/mol)叶酸泛酸维生素B12维生素B1嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343因此ln2/1＞ln2′/1′即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。灭菌温度/℃灭菌时间/min维生素B1破坏量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.01＜1二）影响培养基灭菌的主要因素1、微生物热阻（前述）2、pH◆微生物在pH6.0～8.0范围内耐热性最大◆pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。影响培养基灭菌的主要因素（continued）温度孢子数灭菌时间(min)(℃)(个/ml)pH=6.15.35.04.74.5120100008753311510000252516131311010000706535302410010000740720180150150pH对灭菌时间的影响影响培养基灭菌的主要因素（continued）3、菌的浓度浓度越高，所需灭菌时间越长例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105℃湿热灭菌时间芽孢杆菌数/ml时间(min)9×108489×106369×104209×1021492影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、培养基成分◆油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。◆而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。6、颗粒颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。影响培养基灭菌的主要因素（continued）三、分批灭菌（实罐灭菌）一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓