RNA提取

[Topic]提取Lin-细胞的总RNA[目的]前期预试：采用全骨髓细胞做预试实验，走一遍提取RNA的流程[材料]加2%血清的Hank’s缓冲液或PBS冰袋手术器械注射器平皿，滤布1.5mlEP管（DEPC水泡过高压消毒）2mlEP管（DEPC水泡过高压消毒）移液器枪头（DEPC水泡过高压消毒）TRIzol氯仿，异丙醇（无RNA酶污染）75%乙醇（冰冻）RNAasefreewaterDEPC水小鼠C57BL/6[实验步骤]1取细胞冰袋上操作，全程保证低温。小鼠处死，取胫骨与股骨，按照每只小鼠2ml的量加入缓冲液中（含2%血清的Hank’s液或PBS），用注射器缓慢将骨髓细胞冲出，过滤到离心管中（若需要先培养，则调整细胞浓度为4.00E+06种板，培养一定时间后消化细胞为悬液再进行离心），离心（400g，5min，4℃）。注：如果细胞需要送去其他lab做RNA纯化，就需要将细胞样本离心冷冻在液氮里，并且在干冰中运输；但是，在加入RNAprotectcellreagent时，细胞可以放在室温下保存，也可以在室温下运送。2细胞裂解和均一化离心后，弃去上清（防止上清回流，上清残留过多会造成裂解液效果下降），按每1.5mlEP管加入1mlTRIzol的比例立即加入TRIzol。注：TRIzol能使RNA酶失活，并能降解细胞中的DNA，蛋白质等物质，防止RNA分解变性。裂解液破坏细胞膜和细胞器，将细胞中所有的RNA都释放到样本中，不同的样本需要不同的裂解方式，裂解不完全可能导致RNA收率的降低。3均一化：用1ml加样器吹打液体至澄清无细胞团块5-10min。之后颠倒混匀10下，基本可以使细胞裂解。注：均一化即打断高分子质量的DNA聚合物和其他聚合细胞结构，形成一个均一的裂解生成液。若裂解液不能混匀，则会降低RNA与RneasyMinElutespincolumnmembrane（试剂）的结合程度，显著降低RNA产率，而且可能造成蛋白质污染，造成RNA产率降低。因此在操作过程中可以减少起始样本量，确保裂解完全彻底。4抽提RNA按细胞悬液与TRIzol总体积的1/5加入氯仿，颠倒混匀15s（或更长时间），室温静置5min。在4℃，12000g条件下离心15min。注：加入氯仿后马上混匀，离心分层时间和离心力要足够，否则会降低RNA收率5沉淀RNA转上清至另一只1.5ml的EP管中，加入等体积的异丙醇混匀后室温放置10min。在4℃，12000g条件下离心10min。注：转上清步骤用移液器操作，吸上清时一定不要吸到中间层的蛋白，如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提，因为吸到的蛋白很可能对RNA产生降解作用。宁可少吸也不要贪多，RNA提取重质不重量。加入异丙醇后不需要混匀，静置10min即可。6洗涤RNA离心后弃上清（用移液枪吸干净），加入冰预冷的75%乙醇1ml，在4℃，7500g的条件下离心5min，弃上清。超净台内干燥约5-10min。注：洗涤RNA只一次即可，应尽量减少RNA提取时间，防止RNA降解。上清应用移液器吸去，吸液体时保持离心管竖直，不可倾斜晃动。干燥时保持管口不要朝向风口，以防被吹入RNA酶。若残留75%酒精过多，也会影响扩增效率，可以重新沉淀溶解一次解决；但是若乙醇过度挥发，则RNA不溶于水，会造成后续反转录量不高7加入20-30ul的DEPC水溶解RNA，之后立即用于逆转录，或者保存与-70℃冰箱中保存。注：DEPC使用量不要太多，以保证RNA浓度逆转录时采用的样品量一般为10ul/次。注意事项：1一定注意冰上操作，低温离心2戴口罩，勤换手套3每次取材都用镊子去夹取，镊子要在酒精灯上烧一下4所有器材都要经过DEPC浸泡后高压才可使用，所需氯仿，酒精，异丙醇都要保证未被RNA酶污染，一定用DEPC浸泡过的枪头，如果发现试剂可能被污染，要立即更换5吸上清若吸到中间层的蛋白和DNA，一定要重新用氯仿抽提一次，否则会降低RNA产率，而且DNA对realtimePCR的起始荧光纸会有很大的增加效果，导致无法跑出完整的扩增曲线。