发酵法生产多不饱和脂肪酸的研究进展

书书书中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（４）：１３９～１４５发酵法生产多不饱和脂肪酸张燕鹏１，２　黄凤洪２　杨　湄２　夏伏建２（１华中农业大学食品科技学院　武汉　４３００７０　２中国农业科学院油料作物研究所　武汉　４３００６２）摘要　简要介绍微生物产多不饱和脂肪酸的生化研究现状，着重从高产菌株的筛选、工程菌株的构建、发酵条件及产业化现状等方面论述微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的主要研究进展；概述多不饱和脂肪酸的提取制备技术，并对发酵法生产多不饱和脂肪酸研究目标和发展前景提出了建议。关键词　多不饱和脂肪酸　微生物　发酵　提取纯化中图分类号　Ｑ８１５收稿日期：２００６１０３１　修回日期：２００７０１３０通讯作者，电子信箱：[e-mail]　　多不饱和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ，ＰＵＦＡ）一般是指含两个或两个以上双键，碳链长度在十八或十八以上的脂肪酸，主要包括γ亚麻酸（ＧＬＡ）、二高γ亚麻酸（ＤＨＧＬＡ）、花生四烯酸（ＡＲＡ）、二十碳五烯酸（ＥＰＡ）、二十二碳六烯酸（ＤＨＡ）等。ＰＵＦＡ具有许多重要的生理活性。研究表明ＰＵＦＡ可以转化为前列腺素类化合物（前列腺素ＰＧ、凝血垩烷和环前列腺素）和白三烯等，这些物质具有免疫应答的作用［１］。此外，ＤＨＡ对脑细胞的分裂、增殖和神经传导突触的生长、发育发挥着重要的作用［２～３］。新的报道还称ＥＰＡ可以治疗精神分裂症，对癌症患者也有一定的疗效［４～６］。随着人们对ＰＵＦＡ生物活性认识的不断提高，市场对ＰＵＦＡ的需求也日益增强，仅仅依靠从月见草、黑加仑等植物籽油中提取ＰＵＦＡ已无法满足。虽然从海洋动物如甲壳类和鱼类中也可提取ＰＵＦＡ，但成本太高。而利用微生物生产ＰＵＦＡ，具有生产周期短、生产所占空间小，不受原料、产地和季节限制等独特优势。因此利用微生物发酵生产ＰＵＦＡ已成为当前研究的热点和发展的趋势［７］。１　ＰＵＦＡ在微生物中的合成　　一般认为ＰＵＦＡ在微生物体内的合成是以饱和脂肪酸———硬脂酸为底物，通过脱饱和酶的作用，在特定的碳原子处插入双键，然后再由碳链延长系统合成所需的ＰＵＦＡ。其主要催化酶是膜结合脱饱和酶系，整个脱饱和体酶系由三个酶组成，即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸细胞色素ｂ５（ＮＡＤＨＣｙｔｂ５）还原酶、细胞色素ｂ５酶（Ｃｙｔｂ５）和末端去饱和酶［８］。不同脱饱和酶在脂肪酸链中插入双键的位置不同，研究其作用机制及活性影响因素有利于高产菌株的筛选及优化发酵工艺。Δ６脱饱和酶在亚油酸的第６位碳原子引入双键生成ＧＬＡ，再经碳链的延长与Δ５和Δ４脱饱和酶的脱氢作用分别插入双键，进一步合成了ＡＲＡ、ＥＰＡ和ＤＨＡ。高糖化合物、果糖、胰岛素等对脱饱和酶的合成与活性具有促进作用，低温有利于脱饱和酶活力的提高；而环己酰亚胺和三碘甲酰原氨酸等不利于脱饱和酶的表达。　　最新研究表明，微生物中ＰＵＦＡ的合成尚有其他途径，如真菌中脂肪酸脱饱和酶还可以催化与甘油相连接的脂肪酸脱饱和，且所作用的脂肪酸并不一定要与辅酶Ａ（ＣｏＡ）结合。Ｊｏｎｅｓ［９］认为变形虫Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ中的Δ１２脱饱和酶是酯酰酯脱氢酶类型。Ｓｐｙｃｈａｌｌａ［１０］在线虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ中发现ｆａｔｌ脱饱和酶是甘油酯脱饱和酶。此外，据ＣｏｌｉｎＲａｔｌｅｄｇｅ［７］报道，在一些微生物如Ｓｃｈｉｚｏｃｈｕｔｒｉｕｍｓｐ．和Ｕｌｋｅｎｉａｓｐ．中合成ＤＨＡ的途径与其他的真核真菌不同，是通过类似细菌的多聚乙酰合酶途径（ＰＫＳ）来合成ＤＨＡ的。２　ＰＵＦＡ的微生物发酵生产　　微生物发酵生产ＰＵＦＡ的基础研究主要集中在高产菌株的筛选、工程菌株的构建和发酵工艺的改进等中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２７Ｎｏ．４２００７三大方面，旨在提高ＰＵＦＡ产量，降低成本，更好地推动微生物发酵生产ＰＵＦＡ的产业化。２．１　高产菌株的筛选与工程菌株的构建　　菌株的选择直接关系到油脂产量和目的多不饱和脂肪酸的含量，选择具有工业化生产价值的菌株必须具备以下几个条件：（１）油脂含量丰富，油脂中目的ＰＵＦＡ含量较多；（２）生长繁殖速度快，杂菌污染困难；（３）能适应工业化深层培养，装置简单；（４）风味良好，安全无毒，易消化吸收［１１］。目前在ＰＵＦＡ的生产中具有开发潜力的主要有霉菌和藻类。藻类中可以用来生产ＰＵＦＡ的主要有螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｓｐｐ．）、小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｐｐ）、紫球藻（Ｐｏｒｏｈｙｒｉｄｉｕｍｃｒｕｅｎｔｕｍ）、三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、隐甲藻（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉ）、绿光等鞭金藻（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓｇａｌｂａｎａ）等［１２］。它们生产的ＰＵＦＡ含量最高可以达到总脂肪酸的５０％；常见的产油霉菌有：土霉菌（Ａｓｏｅｒｇｕｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、紫瘫麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｐｕｒｐｕｒｅａ）、高粱褶抱黑粉菌（Ｔｏｌｙｐｏｓｐｏｒｉｕｍｅｈｒｅｎｂｅｒｇｉｉ）、高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）、深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、拉曼被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｒａｍａｎｎｉａｎａ）、雅致小克银汉霉（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｅｌｅｇａｎｓ）等［１３］。　　高产菌株的筛选可以采用物理和化学诱变法及利用基因工程和原生质融合技术进行菌种改造等以获得高产工程菌株。张道海等［１４］利用高山被孢霉（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）经钴６０、γ射线诱变得到突变株ＭＡ９０，在最佳培养条件下ＧＬＡ的产量达到１．１５７ｇ／Ｌ。黄建忠等［１５］以深黄被孢霉（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＡＳ３１３４１０为出发菌株，经紫外线（ＵＶ）、硫酸二乙酸（ＤＥＳ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）等复合诱变选育得到Ｍ０１８突变株，通过在６０Ｌ发酵罐中三级发酵可使生物量达到３７．８ｇ／Ｌ，油脂含量高达７９．２％，油酸、亚油酸、ＧＬＡ总量达到６８．４％。袁成凌等［１６］采用低能离子注入法对高山被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ）进行诱变选育，经连续诱变处理，最终获得一株ＡＲＡ稳定高产菌株Ｉ４９Ｎ１８，其ＡＲＡ得率高达４．６６ｇ／Ｌ。该技术通过微生物发酵法实现了ＡＲＡ规模化生产，在５０ｔ发酵罐中生产ＡＲＡ产量平均达５．１１ｇ／Ｌ。　　通过对微生物合成ＰＵＦＡ途径的研究，还选育出了某些特定位置的脱饱和酶缺陷菌株来发酵生产高含量的ＰＵＦＡ。为提高高山被孢霉中ＥＰＡ含量，Ｊａｒｅｏｎｋｉｔｍｏｎｇｋｏｌ等［１７］筛选出一株Δ１２脱饱和酶的缺陷菌株，培养１０天后，其ＥＰＡ的含量达到１．０ｇ／Ｌ，生物量达到６．４ｇ／Ｌ。Ｋａｗａｓｈｉｍａ等［１８］同样利用高山被孢霉选育出一株Δ５脱饱和酶缺陷型菌株，发酵培养１２天后，其ＤＨＧＬＡ含量提高到７．０ｇ／Ｌ，占总脂肪酸含量的４３．９％，油酸和亚油酸含量分别为７．５％和４．４％，ＧＬＡ含量为３．２％，显示出了良好的ＤＨＧＬＡ生产潜力。　　近年来国内外在分子水平上对微生物脱饱和酶也展开了大量的研究，旨在通过基因工程的手段来改造传统产油微生物，以提高其合成ＰＵＦＡ的能力，使微生物来源的ＰＵＦＡ在经济上更具有竞争力。１９９９年ＥｉｊｉＳａｋｕｒａｄａｎｉ等［１９］从高山被孢霉ＩＳ４（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ１Ｓ４）中分离克隆了Δ６脱饱和酶的基因，在米曲霉中进行了表达，ＧＬＡ在总脂肪酸中的含量达到了２５．２％。同年Ｈｕａｎｇ等［２０］从高山被孢霉中克隆了Δ１２和Δ６脱饱和酶基因，并分别在酵母中得到表达，结果发现Δ１２脱饱和酶基因在合适的培养条件下产生的亚油酸达到总脂肪酸的２５％；Δ６脱饱和酶基因在添加外源亚油酸的基础上产生的ＧＬＡ含量可达到总脂肪量的１０％；当同时在酵母菌中表达Δ１２和Δ６脱饱和酶基因时，其产生的ＧＬＡ达总脂肪酸含量的８％。米曲霉和酵母是很早被用作食品生产的菌种，因此构建米曲霉和酵母工程菌在食品生产应用中具有良好前景。最近ＳｅｉｋｉＴａｋｅｎｏ等［２１］又报道在高山被孢霉ＩＳ４（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａ１Ｓ４）中转入Ｚｅｏｃｉｎ的抗性基因，通过抗性筛选得到菌株ｐＤＺｅｏＧＬＥＬＯｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ＃６３，其ＡＲＡ产量较原始菌株有很大的提高，为进一步提高和控制真菌脂肪酸的产量和组成建立了一个良好的转化体系。国内在这方面也积极展开了研究。张羽航等［２２］成功建立了被孢霉的基因文库，并开始筛选包括脂肪酸脱饱和酶在内的有关脂肪酸合成途径的基因。南开大学较早进行了脱饱和酶分子生物学的研究，２００１年刘莉等［２３］报道把高山被孢霉ＡＴＣＣ１６２６６Δ６－脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中表达，构建了酵母工程菌ＹＭＡＤ６，可以把底物亚油酸转化为ＧＬＡ，其含量占总脂肪酸的３１．６％，随后李明春等［２４］将从高山被孢霉中克隆得到的Δ６脂肪酸脱饱和酶基因同源重组整合到毕赤酵母菌中，生成的ＧＬＡ占总脂肪酸含量的１２．６％。总之，利用基因工程技术构建产ＰＵＦＡ的工程菌，主要是把具有产ＰＵＦＡ能力，但生长缓慢的菌株的基因克隆到生长迅速可高密度培养的微生物如酵母菌中，以降低生产成本。也有人提出可以通过增加编码脱饱和酶的基因拷贝数来提高微生物产酶数量，从而提高ＰＵＦＡ的产量［２５］。０４１２００７，２７（４）张燕鹏等：发酵法生产多不饱和脂肪酸　　虽然借助现代分子生物学技术构建工程菌株有利于推进ＰＵＦＡ的发酵生产，但其基因的表达受到宿主中底物的影响，并且宿主较低的含油量以及遗传稳定性也都会影响工程菌构建研究和推广的进一步发展。而且发酵生产的ＰＵＦＡ大多应用于食品行业，构建的工程菌的毒理安全性尚需实验研究，因此利用基因工程菌发酵生产ＰＵＦＡ仍需要深入的研究。２．２　发酵条件对ＰＵＦＡ产量的影响　　同一种微生物在不同的发酵条件下，其生物量、油脂产量、油脂组成成分也会不同。对ＰＵＦＡ产量产生影响的主要因素有培养基组成和培养条件。其中培养基组成包括碳源、氮源、Ｃ／Ｎ比、无机盐、微量元素等，培养条件包括发酵温度、ｐＨ、通气量等。２．２．１　培养基组成　培养基组成对菌体的生物量、油脂含量以及ＰＵＦＡ的产量有很大的影响。微生物可以利用的碳源很多，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉、甘油等。无论是提高微生物生物量还是油脂含量以及ＰＵＦＡ产量，葡萄糖都是比较理想的碳源。复合碳源的利用可以在某些方面弥补单一碳源的不足，如吴克刚［２６］在利用破囊壶菌Ｔ．ｒｏｓｅｕｍＡＴＣＣ２８２１０产ＤＨＡ研究中发现，果糖和半乳糖能够促进ＤＨＡ的合成，增加ＤＨＡ在油脂中的含量，但并不利于微生物生长和油脂的积累，在整体上不如葡萄糖作为碳源时ＤＨＡ的产量高。随后吴克刚又发现破囊壶菌Ｔ．ｒｏｓｅｕｍＡＴＣＣ２８２１０以葡萄糖为主要碳源，分别添加果糖和半乳糖构成复合碳源，对其生物量和油脂含量几乎没有影响，但ＤＨＡ含量分别提高１０．７％和７．３％，从而使ＤＨＡ产量每升分别提高了７５ｍｇ和４５ｍｇ。王菊芳等［２７］在研究隐甲藻（ＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍｃｏｈｎｉｉＡＴＣＣ３０５５６）悬浮培养生产ＤＨＡ时，同样采用了葡萄糖／甘油（１：１，ｗ／ｗ）复合碳源，生物量上与单一使用葡萄糖没有区别，但ＤＨＡ产量为０．５４ｇ／Ｌ，高于单一使用葡萄糖时的０．２８ｇ／Ｌ。此外，碳源添加量也会影响ＰＵＦＡ的产量，合适的碳源浓度可以得到最大的生物量和ＰＵＦＡ产量，但当浓度超过最佳适量时，生物量和ＰＵＦＡ产量反而会下降。被孢霉Ｍ．ａｌｐｉｎａＡＴＣＣ３２２２２以葡萄糖为单一碳源，在浓度为６．０％时有最高的生物量和ＰＵＦＡ产量，但当葡萄糖浓度增加到８．０％时生物量和ＰＵＦＡ产量均会随之下降［２８］。为减少在工业化生产中使用葡萄糖作为碳源的成本，可以利用一些廉价的碳源作为底物。据报道，用亚毒水平的乙酸（２ｇ／Ｌ）为碳源，卷枝毛霉（ＣＢＳ２０３．２８）能积累粗油脂达２８％，其中９１％为中性甘油三酯，ＧＬＡ产量为４０ｍｇ／ｇ细胞