杨恪鉴超氧化物歧化酶(SOD)的生产

项目四:超氧化物歧化酶(SOD)的生产任务一：SOD制备方案的制定生药1121第五组2011423242杨恪鉴一.SOD的概况二.SOD的运用三.SOD的生产四.SOD的活力测定一.SOD的概况•1.SOD的概念超氧物歧化酶（SuperoxideDismutase简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。2、SOD的分类3、作用原理•⑴基本原理•SOD属于金属蛋白酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（Cu-ZnSOD）、含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基，将之歧化为过氧化氢与氧气。⑵人体内的自由基在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。•4.SOD的理化性质•3.1SOD对氰化物和H2O2的敏感性3.2SOD的吸收光谱特性3.3SOD稳定性及影响因素5.SOD的作用•它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应，即催化超氧阴离子自由基O2-·发生歧化反应，从而清除O2-·，2O2-·+2H+→H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。6、测定•超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。•常用的有：•⑴邻苯三酚自氧化法•⑵细胞色素C还原法（McCord法）•⑶化学发光法•⑷免疫学方法•⑸电泳法3.1SOD对氰化物和H2O2的敏感性•长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响3.2SOD的吸收光谱特性•CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280nm处并没有最大吸收峰。•CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680nm左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。3.3SOD稳定性及影响因素•PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.3～9.6间催化性能良好，在pH4.5～pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。•SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95℃,其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用二SOD的运用•1.药物•SOD是一种新型的抗炎症药，根据SOD作用机制和毒性试验，它对治疗因O2-·引起的各种疾病都有一定的疗效。为此，SOD可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。二SOD的运用•2.添加剂•国外不少高级化妆品都添加SOD，国内也有数家工厂或公司在开发和生产SOD化妆品，如大宝SOD密，康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD作为化妆品添加剂主要有3个优点：•（1）有明显的防晒效果•（2）可防皮肤衰老，阻止紫褐质（老年斑）的形成•（3）有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。•国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨SOD饮料。SOD及修饰过的SOD还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂二SOD的运用•3.生化试剂•国外已有数家公司如Sigma公司等出售SOD试剂，国内也有厂家批量生产SOD试剂，如中科院上海生化所东风试剂厂、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作为某些疾病的探针，如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体Mn-SOD降低是转化细胞的可靠生化指标之一，并可作为评估脑瘤分化程度的参考。•综上所述，随着人们对SOD更广泛深入的研究，不同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。三.SOD的生产1.SOD酶的提取称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。2.去除杂蛋白•上清液中加入0.25倍体积的氯仿——乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液•3.SOD酶的沉淀分离•粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀三.SOD的生产•4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。•5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量•6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定•原理•连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在325nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。•仪器•紫外分光光度计、pH计,离心机•试剂•⑴0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml⑵pH=8.3Tris-HCl缓冲溶液•①0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液:NH2C(CH2OH)3121.14•取12.114g,溶解，定容至100ml•②0.1mol/L盐酸:取8.6(9)ml浓盐酸，稀释至1000ml•③50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液•19.9_毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。•(保存温度:常温密封避光保存)测定步骤•酶液的制备•称取6g样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min,取上清液用于酶活测定。•连苯三酚自氧化速率的测定•取4.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入10连苯三酚液，迅速摇匀•空白：取4.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入10缓冲液，迅速摇匀•倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次•计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min•酶活测定•测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，•取1.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10连苯三酚液，迅速摇匀•空白：取1.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10缓冲液，迅速摇匀•计算加酶后连苯三酚自氧化速率结果计算•样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g鲜重•样品酶活单位=•式中——酶样品在325nm处每分钟光密度变化值•V——反应液体积•n——酶液稀释倍数（若酶液足够多，可不稀释即n为1）五.SOD使用及生产时的注意事项•1.SOD的安全性•大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。•2.SOD生产时的注意事项2.1在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底2.2PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等2.3要学会正确使用分光光度计谢谢！