第五章-发酵工程的灭菌与空气除菌-董媛

检验学院第五章发酵工程的灭菌与空气除菌吉林医药学院董媛检验学院本章内容常用灭菌方法和发酵设备种类1培养基的灭菌2发酵设备的清洗和灭菌3空气的除菌4灭菌“sterilization”：采用物理或化学方法杀死或除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。※※灭菌与消毒消毒“disinfection”：采用物理或化学方法杀死容器、器具内外、车间、厂区等环境中的病原微生物，但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。例如巴氏灭菌法（60℃，30min）。实验室内哪些操作属于灭菌，哪些属于消毒呢？1、干热灭菌法常用烘箱，灭菌条件为在160℃下保温1h，适用范围：金属或玻璃器皿灭菌的方法原理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。3、化学试剂灭菌法化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒2、射线灭菌法电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱、工业原料紫外线杀菌的机理微生物细胞在紫外线照射下细胞中DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制；空气在紫外线照射下产生的臭氧（O3）也有一定的杀菌作用。化学灭菌的机理一些化学物质与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、核酸的破坏、酶类失活、细胞膜透性的改变而杀灭微生物。试举例几种常用化学消毒剂浓度及使用范围？5、臭氧灭菌法适用范围：洁净室和净化设备消毒4、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气臭氧发生器过滤除菌的方法用0.01~0.45μm孔径滤膜对压缩空气、酶溶液、啤酒及其他不耐热化合物溶液除菌。过滤除菌的原理利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。实验室内用过哪些过滤器呢？※※5、湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30min适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌例：高压灭菌锅湿热灭菌的机理借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热而凝固变性。湿热灭菌的温度和时间需根据灭菌对象和要求来决定。思考为什么湿热灭菌效果比干热灭菌效果好?检验学院工业上具体措施包括（1）使用的培养基和设备须经灭菌；（2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；（5）使用无污染的纯粹种子。第二节培养基与发酵设备的灭菌检验学院一、培养基的灭菌（一）培养基灭菌方法1.分批灭菌2.连续灭菌※※2.1发酵培养基的灭菌1）分批灭菌：又称间歇灭菌，是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通往蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程也称为实罐灭菌。1）分批灭菌优点：不需要其他设备，操作简单易行，规模较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法。缺点：1）加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利用率降低。2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。时间/min温度/℃冷却保温501001501208040160200240加热2）连续灭菌概念：是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭菌过的发酵罐中的灭菌方式，也称为连消。条件：在短时间加热使料液温度到灭菌温度126-132℃，在维持罐中保温5-8min，快速冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。2）连续灭菌优点：1)减少养分破坏，产品质量较易控制2)提高产量，缩短发酵周期3)设备利用率高，操作方便4)适于自动控制，劳动强度低缺点：需外设加热、冷却装置，操作复杂，染菌机会多，不适合含有大量固体物料培养基的灭菌。常见的连续灭菌的流程连消塔—喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程2）连续灭菌发酵工程1）培养基成分2）培养基成分的颗粒性3）培养基的pH4）微生物细胞的含水量※2.1.2影响培养基灭菌的因素5）微生物性质与数量6）冷空气排除情况7）泡沫8）搅拌2.1.2影响培养基灭菌效果的因素※※2.2.培养基灭菌动力学——对数残留定律***微生物死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比——对数残留定律即KNdtdN死亡速率残存活菌数灭菌时间（min）热死速度常数（杀菌速度常数）与菌的种类和加热温度有关（min-1）。是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。K值俞小，则此微生物俞耐热。检验学院N0---灭菌开始(t=0)时，原有活菌数（污染度)Nt---经过灭菌时间t后残存活菌数实际设计时常采用Nt=0.001000lg303.2ln1)/ln(NNKNNKtKtNNtttNNtdtKNdN00/积分存活率•空罐灭菌•空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。•为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。2.3发酵设备的灭菌检验学院※※第三节空气的除菌检验学院分布规律：微生物在空气中的分布情况与空气环境因素有关，空气质量愈好，微生物的种类及数量愈低。发酵工厂通常采用高空采气的方法。检验学院二、发酵用无菌空气的概念和质量标准为确保生产在纯种培养状态下进行，严格无菌条件下发酵用无菌空气的质量标准要求如下：①连续提供，保持一定流量；保证发酵罐0.1-2.0V/VM的需气量；②保持一定的压强；表压达到0.2~0.4MPa。③空气的相对湿度在进入发酵罐之前≤70%。④进罐前的空气温度要比培养温度略高或相同。⑤洁净度达到N=10-3；检验学院三、空气净化的方法热灭菌法辐射灭菌法静电除菌法介质过滤除菌法检验学院二、空气除菌的方法检验学院二、空气除菌的方法检验学院空气的过滤除菌过滤介质绝对过滤深度过滤介质的空隙小于被拦截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纤维素酯材料做成的微孔滤膜。介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质有一定厚度，机理是静电，扩散，惯性及拦截作用。如棉花过滤器，超细玻璃纤维纸，金属烧结管等。检验学院检验学院（二）空气过滤除菌的原理介质过滤是以大空隙的介质过滤层除去较小颗粒，这显然不是面积过滤（即不是绝对过滤），而是一种滞留现象。这种滞留现象是由多种作用机制构成的，主要有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重力沉降和静电吸引等。检验学院1、惯性冲击滞留作用当微生物等颗粒随空气以一定速度流动，在接近纤维时，气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前进。但微生物等颗粒由于具有一定质量，在以一定速度运动时具有一定惯性，碰到纤维时，由于惯性作用而离开气流碰到纤维表面上，由于摩擦、粘附作用，被滞留在纤维表面上。这种现象称作惯性冲击滞留作用（二）介质过滤除菌的原理检验学院惯性冲击滞留作用气流速度下降到微粒的惯性力不足以使微粒脱离主导气流对纤维产生碰撞，即在气流的任一处，微粒也随气流改变方向而绕过纤维前进，即b=0，纤维的碰撞滞留效率等于0，这时的气流速度称为惯性碰撞的临界速度vc。vc=Vs1－Vs—容器截面的空气速度；—介质填充密度惯性碰撞的临界速度受填充密度的影响检验学院2、拦截滞留作用当气流速度在临界速度以下，颗粒不再由于惯性碰撞而滞留。但是，颗粒质量很小，在气流绕过纤维时，颗粒仍然随气流运动，在气流速度低时，在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞流区内气流速度更慢，进入滞留区的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘附作用而被滞留。这就是阻截（拦截）滞留作用检验学院3、布朗运动直径小于1m的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的直线运动，即布朗运动。使较小的颗粒凝聚为较大颗粒，随即可能产生重力沉降或被过滤介质截留；气流速度大时，凝聚现象为惯性碰撞所取代检验学院4、重力沉降作用再小的微粒也有重力；当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就会沉降。对于小颗粒而言，只有在气流速度很慢时才起作用。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕获效率。检验学院5、静电吸引作用许多微生物和孢子都带有电荷具有一定速度的气流通过介质滤层时，由于摩擦作用而产生诱导电荷当菌体所带电荷与介质电荷相反时，即发生静电吸附作用检验学院（一）空气过滤除菌的介质1）纤维及颗粒状介质的过滤器：用于总过滤器。1）棉花宜选用纤维细长、疏松的新棉花；2)活性炭3mm,长5–10mm,圆柱状，有较大的表面积，通过物理吸附作用而吸附微生物。；3）玻璃纤维8–19m；四、介质过滤除菌的原料检验学院过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入0.2-0.4Mpa的蒸汽，灭菌45min后用压缩空气吹干备用。总过滤器约每月灭菌一次。检验学院纤维素酯微孔滤膜，孔径≤0.5μm检验学院硅酸硼纤维微孔滤膜：孔径0.1μm检验学院介质:超细玻璃纤维纸。孔径:0.5-5μm厚度:0.25-1mm实密度:2600Kg/m3填充率:14.8%。除菌效率高，阻力小，强度低。用酚醛树脂，甲基丙烯酸树脂等处理以提高防湿能力用多孔板夹住提高其抗冲击能力。2).滤纸过滤器：利用高质量的无碱玻璃采用喷制法制成的1–1.5m的细丝；检验学院检验学院3）金属烧结管空气过滤器：压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管的壁除去杂菌和颗粒，得到的无菌空气由管程排出。使用寿命长，耐高热，气体阻力小，安装维修方便。空气预过滤器和蒸汽过滤器。检验学院4）微孔膜过滤器----绝对过滤器：由耐高温，疏水的，厚度为150μm的聚四氟乙烯薄膜构成。能绝对滤除所有的大于0.01μm以上的微粒，能除去几乎所有空气中夹带的微生物。过滤器体积小，处理量大，压降小，除菌效率高检验学院聚四氟乙烯微孔滤膜：孔径0.2μm或0.5μmFluoropore（TPFE）：0.2μm，阻力小，疏水性好，不受水的影响而堵塞滤孔，耐1250C高温检验学院2、空气净化的流程：粗过滤器一级冷却器空气加热器分过滤器无菌空气二级冷却器分水器空气贮罐旋风分离器空气压缩机丝网除末器空气吸气口总过滤器空气高空吸入前过滤空气压缩冷却油、水分离加温空气总过滤器分过滤器(无菌空气)发酵罐/种子罐五、空气过滤除菌流程检验学院（一）空气预处理空气预处理的主要目的：1．提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的负荷。2．去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空气湿度和温度进入空气过滤器。采风塔:≥10m,上风头,流速8m/s.五、空气过滤除菌流程检验学院（二）空气预处理2．粗过滤器安装在空气压缩机前的粗过滤器，其主要作用：捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受损，同时也可减轻总过滤器负荷。粗过滤器一般要求过滤效率高，阻力小，否则会增加空气压缩机的吸入负荷和降低空气压缩机的排气量。常用的粗过滤器有：布袋过滤、填料式过滤、油浴洗涤和水雾除尘等。检验学院布袋过滤：结构最简单布质结实细致，则过滤效率高，但阻力大。最好采用毛质绒布效果较好，现多采用合成纤维滤布。滤布要定期换洗，以减少阻力损失和提高过滤效率。检验学院3、空气压缩机分为离心式（涡轮式）和往复式空气压缩机。空气除菌中除去水雾油雾的原因：（1）油导致传热系数降低，给空气冷却带来困难。（2）油雾的冷却分离不干净，带入过滤器会堵塞过滤介质的纤维空隙，增大空气压力损失。（3）黏附在纤维表面，可能成为微生物微粒穿透滤层的途径，降低过滤效率，严重时还会浸润介质而破坏过滤效果。（4）将介质打湿，使过滤器渗漏。检验学院旋风分离器：利用离心力进行沉降水和油滴；介质过滤器：利用惯性进行