益生素生产技术基础知识

益生素生产技术基础知识1、益生素简介1.1益生素的概念益生素是微生态调节剂的一个种类，也可叫做微生物饲料添加剂。我国动物微生态学家和营养学家将其定义为：在动物微生态学理论的指导下，用正常微生物群成员，通过鉴定、培养、干燥等一系列工艺制成的一种活菌制剂及其代谢产物。它可直接饲喂动物，以促进动物生产性能为目的的活菌制剂。但也有学者认为益生素也应包括灭活菌体及代谢产物、和具有调节动物微生态平衡的其它制剂。微生态调节剂是指能够调节动物微生态平衡、促进动物健康及生产性能的制剂，其主要包括：益生素、益生源、合生素。益生源的概念：益生源是一种不被宿主消化，能选择性地刺激一种或几种肠内常住菌的活性或生长繁殖，并能增进宿主健康的可食用物质。目前畜牧业用的益生源主要是低聚糖。合生素的概念：合生素是由益生素与益生源或其它功能成份复配而成的制剂。益生素的其它定义：直接饲喂的微生物制品（美国食品与医药管理局）。能够促进肠内菌群平衡，对宿主起有益作用的活菌制剂。含活菌或死菌包括其组分和代谢产物的微生物制品，经口或其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制的制品。1.2益生素的种类按制品剂型可分为：液体剂型和固体剂型液体剂型：一般是将发酵菌悬液（或浓缩液）与其它功能成份混合复配制成。固体剂型：一般是将发酵液或收集的菌体附着于载体经干燥、粉碎、包装而成。按制品所含有效微生物种类多少的不同可划分为：单一有效菌剂，多菌复合剂。单一有效菌剂：即有效活菌为某一种微生物构成的制剂，如乳酸菌剂、芽孢菌剂、酵母菌剂。商品如“赐美健”等都是单一菌剂。多菌复合剂：即有效菌是由二种或二种以上微生物构成的制剂。国内大部分是此类型制剂。按是否添加非微生物功能成份可分为：单纯微生物制剂，复合制剂单纯微生物制剂：即主要有效成份为微生物。复合制剂：即主要有效成份由微生物和其它功能成份（如酶制剂、寡糖等）共同组成。如：星星协力公司的产品，宝来利来的产品。1.3益生素生产的常用菌1.3.1益生素生产用菌应具备的条件：1.3.1.1必须具备的条件（1）安全性。生产用菌不能产生有毒有害物质。从原则上讲，所用菌种必须进行严格的毒性试验，证实其安全性后方可使用。（2）具有促进动物体内菌群平衡或预防失衡的功能。1.3.1.2其它非必备条件（1）营养功能。能够分泌产生营养性物质或产生利于营养物质形成及吸收的物质，防止有害物积累的功能。这对促进动物生长，保持健康有直接的关系。（2）具有产生抗菌物质的能力。如产生抗菌素、有机酸等。（3）对动物肠壁具有粘附性能和定植抗力。此功能可使有益菌在肠道中长期发挥作用，可排斥病原菌的侵袭，是高档益生素应具备的条件。（4）具有一定的抗逆性。a、应能耐受胃酸、胆汁、胰液而不失活的。b、制成品中活菌应能保持较长时间。（5）在肠道环境内具有较好的繁殖和代谢能力。（6）生产的可操作性。做为一种工业制品，必须考虑生产成本及操作的可行性。应选择易培养、易保存、特性遗传稳定、生产工艺简单的菌株。1.3.2常用菌及其功能特点1.3.2.1乳酸菌乳酸菌是指能发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这个名称以分类学而言是不规范的。益生素所用乳酸菌最好是从该动物消化道中分离获得，以利于在宿主体内定植。由乳酸菌制得的益生素，一般为活菌制剂，但也有少数为灭活菌体与其代谢产物制成的制剂，其作用原理解释为：①灭活的菌体能与肠壁粘膜结合起到占位优势，防止有害菌的侵袭②代谢产物具有抗菌物质。我国农业部允许用作饲料添加剂的乳酸菌有：干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌，共七种。乳酸菌的功能与作用机制：（1）预防肠道功能紊乱，调节肠道菌群平衡。乳酸菌通过自身代谢产物和其它细菌之间的相互作用调整菌群之间的关系，维护和保证菌群最佳优势组合和组合的稳定。这种作用主要取决于其粘附、竞争、占位和产生抑菌物的特性。乳酸菌可产生如下抗性物质：①产酸。乳酸菌在体内发酵糖类，产生大量乳酸、醋酸，使环境PH下降，肠道处于酸环境；对病原性沙门氏菌、志贺氏菌、金黄葡萄球菌等具有拮抗作用，抑制其生长。②产生过氧化氢。某些乳酸菌可产生H2O2，抑制葡萄球菌等致病的生长，在细菌种群间的相互竞争中占优势。③产生酶类。某些乳酸菌产生胞外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复合多糖，由于这些糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体，通过酶的作用，可以防止毒素对上皮细胞的粘附和侵入。④产生抗菌素。许多乳酸菌产生抗菌素，可对体外多种病原菌有拮抗作用。⑤分解胆盐。有些乳酸菌可将结合的胆酸分解为游离的胆酸，游离的胆酸对细菌有较强的抑制作用。（2）免疫复活功能。大量研究证明，乳酸菌具有诱导干抗素、促进细胞分裂、产生体液免疫和细胞免疫的功能。（3）营养作用。乳酸菌发酵后产生的有机酸，可提高Ca2+、Fe3+等的利用率，促进铁和维生素D的吸收。（4）控制内毒素。乳酸菌可抑制肠道内腐败菌的繁殖，从而减少肠道中毒胺、靛基质、吲哚、氨、硫化氢和尿素酶的含量，使血液中毒素和氨含量下降，从而也降低了肝脏负担。1.3.2.2芽孢杆菌动物肠道中另星存在芽孢杆菌，用于益生素的芽孢杆菌是肠道的过路菌，不能定植于肠道中。现农业部允许用于饲料添加剂的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌。益生素中的芽孢杆菌具有以下功能：(1)促进有益菌的生长。基于“生物夺氧”学说，芽孢杆菌(好氧的)能消耗肠道内氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌生长，从而使失调的菌群平衡调整为正常状态，达到防治疾病的目的。(注：正常情况下，动物肠道中占优势的微生物主要由厌氧菌群构成，对数平均值在99%以上)此项功能是非常重要的，它可派生出乳酸菌的所有功能。(2)拮抗肠道内有害菌大量研究表明，芽孢杆菌能产生多肽类抗菌物质，抑制病原菌在肠道内繁殖。(3)产生多种消化酶，促进营养的吸收。可产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，参与饲料消化，促进动物生长。(4)增强机体免疫力，提高抗病能力。研究发现，饲喂有益芽孢杆菌可促进机体免疫器官的生长发育，提高机体的免疫能力。(5)促进动物器官的生理机能成熟，改善动物的生产性能。研究表明，饲用有益芽孢杆菌可促进肠道结构和机能的成熟，可增强机体对糖原的利用程度，提高多糖代谢水平及提高蛋白质合成水平。1.3.2.3酵母菌酵母菌用于益生素：一种是活性酵母制剂，一种是酵母培养物。酵母及其培养物的应用年代已久，开始多用作反刍动物的蛋白质资源，实践证明，酵母及其培养物对促进反刍动物生产性能有明显效果。对其作用机理一般认为：酵母及其培养物具有刺激瘤胃微生物群生长的作用。进而派生出：增加乳酸的利用、提高氨利用率、增加蛋白合成、稳定瘤胃PH值、提高纤维素消化率等等作用。其能够刺激瘤胃微生物生长的原因一般解释为：含有丰富的维生素(B)、酶、多肽及未知生长因子等促进瘤胃微生物生长的物质。现在酵母及培养物已广泛应用于各种动物的养殖中。目前农业部允许用于益生素的酵母菌有：啤酒酵母、产朊假生酵母。用做益生素的其它微生物还有光合细菌、曲霉、放线菌、拟杆菌、蛭弧菌等。2、常见的生产工艺流程根据所用菌种特点、剂型及生产条件，益生素可采用如下生产流程：2.1液体发酵类试管菌种↓菌种扩培（可用三角瓶或茄瓶）↓菌悬液种子罐培养↓培养菌液发酵罐培养↓发酵菌液↓↓↓↓（发酵←菌体分离载体→混合浓缩其它成份→复配乏液）↓菌泥↓湿菌粉发↓载体→混合（可造粒）干燥酵包装↓湿菌粉↓干菌粉液干燥复配←其它成份↓↓↓干菌粉↓载体→混合复配←其它成份粉碎包装湿菌粉↓↓↓干菌粉干燥包装其它成份→复配复配←其它成份↓↓包装包装注：对于易失活的乳酸菌，可在适当的生产环节做包被处理。2.2固体发酵类试管菌种↓菌种扩培（三角瓶液体培养或固体培养或茄瓶斜面培养）↓种子↓↓发酵罐培养固体培养固体种子液体种子液固体发酵↓发酵物干燥↓干燥物粉碎↓加其它成份→复配↓包装益生素的生产从工艺过程上看很简单，但从产品功效对生产要求的角度来考虑，其生产技术变得即深遂又复杂。3、菌种的选育、制备与管理筛选出高性能的菌株是益生素产品的技术核心。好的菌种及其培育、加工过程是保证益生素生态效应的基础。如何选育或构建优良菌株，进而确定培养条件涉及多学科、多层次的理论与技术问题。3.1菌种的选择依微生态学原理，按来源于自然、回归于自然的准则，选出与宿主、原环境、原微生态、原微群落相适应的菌种是最理想的。但实际上很难做到。当前，人们一般是从历史成果、微生物学特性、饲喂效果、生产特性等出发进行选种。选择的菌种应具备的条件见1.3.1《益生素生产用菌应具备的条件》，但一个菌株一般不会满足所有的条件。3.2菌种的选育为了提高菌种的有益功能，常常需要对菌种进行改造。菌种的改造可通过诱变或遗传工程的手段。在一般的中小企业中诱变育种是最广泛使用的手段。以下简要介绍诱变剂及诱变育种的步骤和方法。3.2.1诱变剂与诱变处理常用诱变剂大体可分为物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂三类。物理诱变剂有：紫外线、X射线、γ－射线、快中子、α－射线、β－射线、超声波、激光等。化学诱变剂有：碱基类似物、烷化剂及移码诱变剂等。工业常用的有：紫外线。紫外线诱变的有效波长范围是200~300纳米。紫外线所以能杀菌或诱变，主要是紫外线的作用光谱与核酸的吸收光谱一致，DNA最易受紫外线的影响。一般诱变用紫外线由15W、30W紫外灯提供。紫外线处理细胞悬浮液的方法：取培养好的新鲜斜面菌种，用灭菌生理盐水洗下，倒入盛有玻璃珠的100ml三角瓶中，充分摇动10分钟，用滤纸或脱脂棉过滤，得分散单孢子悬浮液。调整悬浮液密度为105~106个/ml;吸取上述孢子悬浮液4~5ml，倾于直径为9cm底部平整的平皿中，因紫外线易被水吸收，故皿内孢子悬浮液厚度不需要超过2mm。照射前先开紫外灯20分钟，使灯的功率稳定。培养皿置于磁力搅拌器上，放在紫外灯正中下方，距离20cm，先整个平皿照射1分钟，打开盖，并启动电磁搅拌器，照射一定时间。关紫外灯，将照射后的孢子悬浮液涂平皿、培养。电离辐射时，常用的电离辐射有、X射线、γ－射线、β－射线和快中子等。它们都是电磁波，并以量子形成放射能量，作用于某物质时，产生电离作用，导致DNA结构的改变，引起突变。X射线由X光机产生，γ－射线来自于放射性同位素及核反应堆，使用剂量一般为2~15万伦琴。快中子来自核反应堆或加速器，使用剂量10~150千拉德。电离辐射的使用：用薄壁小试管或塑料容器盛装待处理菌悬液或菌落，放置在辐射源前一定距离进行照射。然后稀释涂平皿培养。碱基类似物，这是一类分子结构和天然碱基相似的化合物。这些化合物作为微生物的培养基时，很容易渗入到微生物DNA分子中去，通过DNA复制而引起突变。常用碱类似物有嘧啶、嘌呤类似物：如5－溴尿嘧啶（5－Bu或5－Fu），2－氨基嘌呤（2－Ap）等等。碱基类似物的使用：将待处理微生物涂布于含一定浓度的碱基类似物培养基平皿上，在培养中得到处理，5－Bu或5－Fu的剂量为5~30mg/ml，如菌体经过饥饿培养，可提高碱基类似物的渗入量，诱变效果更好。烷化剂。烷化剂主要包括：硫芥、氮介、环氧衍生物、硫酸酯、亚硝基类化合物、重氮烷、乙撑亚胺等，是一类重要的诱变剂。常用的烷化剂：甲基磺酸乙脂（EMS）、亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙脂、亚硝基乙基尿、乙撑亚胺。烷化剂的使用：（可参考相关书籍）。3.2.2诱变育种的步骤与方法诱变育种包括诱变和筛选两个步骤，即用诱变剂处理微生物细胞，引起突变，再通过筛选，获得优良菌株。其流程如下：出发菌株↓原种特性考察斜面培养→或液体培养↓↓单孢子悬液菌悬液↓↓诱变处理←↓稀释涂布↓观察菌落形态，选取功能菌株挑取单菌落接斜面或平皿↓对照试验保藏菌种（沙土、冻干、砖坯胶、琼脂斜面等）↓传种斜面↓平皿或摇瓶复筛↓选高性能菌株、保藏，并做稳定性试验，安全鉴定↓放大试验（可用发酵罐）↓各项鉴定投入生产一些要考虑的问题：（1）出发菌株的选择。一般选取已具有某项功能，但需加强的常用生产菌株。（2）在众多菌株中，选取对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株。在不了解出发菌株敏感性的条件