发酵过程与控制2

主要内容微生物发酵类型1工艺控制参数2发酵过程代谢变化3菌体浓度的影响和控制4温度的影响及其控制5PH值影响及其控制6溶氧的影响及其控制7泡沫的影响及其控制9发酵终点的判断10补料控制82溶解氧DissolveOxygen(DO)需氧微生物生长所必需。纯氧在水、盐或酸中的溶解1.26mmol/L在28℃氧在发酵液中100％的空气饱和浓度只有0.25mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在15~30s便耗竭。溶氧的影响及控制3一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速率或呼吸强度（QO2）：单位重量的细胞(干重)在单位时间内所消耗的氧气，mmolO2/(g菌·h)摄氧率(r)：单位体积的发酵液在单位时间内所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1。r=QO2.XX——细胞浓度（g/L)返回4二、影响需氧的因素菌体浓度X：直接影响培养液的摄氧率。QO2：呼吸强度又受到很多因素影响r=QO2.X5二、影响需氧的因素呼吸强度QO2的影响因素（五点）遗传因素：不同的微生物呼吸强度是不同的。一般为25～100mmolO2/(L·h)。菌龄：一般幼龄菌生长旺盛，呼吸强度大；老龄菌生长慢，呼吸强度小。代谢类型：若产物是通过三羧酸循环(TCA)获取，则呼吸强度高，如Glu、天冬氨酸的生产；若糖酵解途径(EMP)，则呼吸强度低，如苯丙氨酸、亮氨酸的生产。6培养基的成分与浓度培养基成分尤其是碳源对细胞的耗氧量有很大影响。培养基的浓度也会影响细胞的耗氧速率。营养丰富，菌体生长快，耗氧量大.此外，若培养基中含有生长抑制剂时，呼吸强度也回受到限制。不同碳源对青霉素摄氧率的影响内源呼吸？外源呼吸？如果外界没有供给能源，而是利用自身内部储存的能源物质进行呼吸在正常情况下，微生物利用外界供给的能源进行呼吸7发酵条件温度、pH通过对酶活性的影响而影响菌体细胞的耗氧温度还影响发酵液中的溶氧浓度有些有害物质的积累，如NH3、CO2会抑制微生物的呼吸返回8三、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrCCr：呼吸临界氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。QO2CL（溶解氧浓度）当溶解氧浓度高于临界值时，微生物的呼吸强度保持恒定，与培养液中的氧浓度无关；当低于这个临界值时，微生物的呼吸强度受到溶解氧浓度的影响，这时细胞的代谢活动会因溶解氧浓度的限制受到影响。p1079注意：有时产物合成临界氧浓度和菌体生长所需的呼吸临界氧浓度会不一样：头孢菌素卷须霉素生长CCr为5%(相对于饱和浓度）CCr为13%产物13%8%（即低于13%时产物的形成会受到抑制）一般对于微生物：CCr:＝1～25%饱和浓度例：酵母4.6×10-3mmol.L-1,1.8%产黄青霉2.2×10-2mmol.L-1,8.8%10溶解氧浓度对菌体生长和产物的形成会产生不同的影响。对菌体生长的影响显而易见。谷氨酸、精氨酸和脯氨酸发酵时，若供氧不足，其积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。对抗生素发酵来说，氧的供给就更为重要。如金霉素发酵，在生长期短时间停止通风，就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径，由戊糖磷酸途径转向糖酵解途径，使金霉素产量减少。11在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。即使是专性好氧菌，过高的溶氧对生长可能不利。氧的有害作用是通过形成新生O，超氧化物基O2-和过氧化物基O22-等破坏细胞体现的。另外，次级代谢产物的生产，控制生长不使过量是必须的，否则产量会减少。如，亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限、细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸，如果供氧充足，产物形成反而受到抑制。12在天冬酰胺酶发酵中，前期是好氧培养，后期转为厌氧培养，酶活可大大提高。所以掌握由好氧转为厌氧的时机颇为关键。据实验研究，当溶氧下降到45%空气饱和度时由好氧切换到厌氧培养，并适当补充营养可提高酶活6倍。而异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，供氧充足可得最高产量，但供氧受限，产量受影响并不明显。13氧的满足程度氨基酸的相对产量返回14四、发酵过程中溶解氧的变化在正常发酵条件下，每种产物发酵的溶氧变化都有自己的规律。15在谷氨酸发酵前期，产生菌大量繁殖，需氧量不断增加。此时的需氧量超过供氧量，使溶氧明显下降，出现一个低峰，发酵液中的菌浓同时出现一个高峰。过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧经过一段时间的平稳阶段后，就开始形成产物，溶氧也不断上升。谷氨酸发酵的溶氧低峰约在6～20h，低峰出现的时间和低峰溶氧随菌种、工艺条件和设备供氧能力不同而异。16引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：①污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近；②菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；③某些设备或工艺控制发生故障或变化，搅拌功率变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。消泡剂因自动加油器失灵或人为加量太多，也会引起溶氧迅速下降。在发酵过程中，有时出现溶氧明显降低或明显升高的异常变化，常见的是溶氧下降。17在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧出现改变，如菌体代谢出现异常，耗氧能力下降，使溶氧上升。特别是污染烈性噬菌体，影响最为明显，产生菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧有可能上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧就直线上升。由上可知，从发酵液中的溶氧变化，就可以了解微生物生长代谢是否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，帮助我们查找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。返回引起溶氧异常升高的原因18溶氧控制的一般策略：前期大于临界呼吸溶氧浓度有利于菌体生长，中后期满足产物的形成。发酵液的溶氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。因此要控制好发酵液中的溶氧，需从这两方面着手。五、发酵过程中溶解氧的控制19一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是增大通气的时间一定要把握好。例：生产肌苷酸：通气量不变17.15mg/ml24小时增加22.55mg/ml30小时增加18.25mg/ml36小时增加12.34mg/ml20溶氧控制在发酵过程控制中的应用国内外都有将溶氧、pH和补糖综合控制用于青霉素发酵的成功例子。控制的原则是加糖速率应正好使培养物处于半饥饿状态，即仅能维持菌的正常生理代谢，而把更多的糖用于产物的合成，并且其摄氧率不至于超过设备的供氧能力KLa，如下图。21氧控制点其加糖阀由控制器操纵。当培养液的溶氧高于控制点时，加糖阀开大，糖的利用需要消耗更多的氧，导致溶氧读数下跌；反之，加糖速率便自动减小，摄氧率也会随之降低，引起溶氧读数逐渐上升。图溶氧在加糖控制中的应用KLa因子推动溶氧上升总摄氧率驱动溶氧下降加糖阀+5%补糖阀开大－5%补糖阀关小氧浓度100%饱和补料的控制补料分批发酵(fed-batchculture，FBC)：又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。1FBC的作用1）可以控制抑制性底物的浓度高浓度营养物抑制微生物生长：①基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；②高浓度基质能使微生物细胞热致死(themaldeath)，如乙醇浓度达10％时，就可使酵母细胞热致死；③有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚(3％～5％)可凝固蛋白；④高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。有的底物溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中，因它们的溶解度小，使基质的浓度低，造成转化率不高。采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，解除抑制作用，得到高浓度的产物。2）解除或减弱分解代谢物的阻遏有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02％水平，赤霉素浓度可达905mg／L；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。3）可以使发酵过程最佳化分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。FBC的优点：①解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；②避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质；③可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量；④不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。2补料内容①能源和碳源；②氮源；③微量元素；④诱导物；3补料的原则原则：根据菌体生长代谢规律；生产需要；环境条件方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）4补糖的控制补糖时机过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pH，菌形态等），在需要时加入；补糖方式连续流加：每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。少量多次间歇补入大量少次补入可与其他组分一起进行多组分补料。以不引起发酵液成分剧烈波动为前提；补糖量——加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度；例：a四环素发酵还原糖维持在0.8-1.2%b谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度。优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵；总糖浓度达20%，产酸高。补糖开始时，不但CO2的释放率、耗氧速率大幅度提高，连呼吸商也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。5补偿氮源及无机盐流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮。谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多2%，流加次数少脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少0.6%，流加以少量多次好6补料的控制流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器三个单元所组成。根据控制依据的指标不同，又分为直接方法和间接方法。间接方法：以溶氧、pH值、呼吸商、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数。对间接方法来说，选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标，是研究的关键。通气发酵利用排气中CO2含量作为FBC反馈控制参数是较为常用的间接方法。直接法：随着一系列技术障碍的克服，该法将会得到迅速普及。反馈控制的FBC，常常是依据个别指标来进行，在许多情况下，并不能奏效，尚需进行多因子分析。FBC还可采用“放料和补料”(withdrawandfill)方法：发酵一定时间，产生了代谢产物后，定时放出一部分发酵液(可供提炼)，同时补充一部分新鲜营养液，并重复进行。维持一定