Transwell实验技术(corning)

Transwell®通透性支持物的选择和使用手册contents目录总览选择合适的Transwell膜和合适的孔径选择合适的Transwell系统如何使用Transwell通透性支持物使用提示常规使用指南技术支持订购信息聚酯（PET）Tranwell嵌套胶原包被的Tranwell-COL嵌套聚碳酯Transwell嵌套Snapwell嵌套高通量筛选HTSTranswell-24系统6，12和24孔细胞培养板HTSTranswell-96系统020203060606070808080910101112总览020.4μm孔径聚碳酯膜的扫描电镜在6孔板中的聚酯Transwell透明嵌套显示膜的清晰度12mm直径的Transwell嵌套带有聚碳酯膜PTFE膜的扫描电镜，显示孔径结构细胞和组织培养技术在基础和应用生命科学领域的重要性日益提高。为尽可能的模拟体内环境以培养某些特殊的细胞系，新的培养容器和细胞贴附的表面不断涌现。顺理成章的，使用带有多微孔膜的通透性支持物培养这些细胞成为基本的方法。通透性支持物可以有效改善极性细胞的培养，因为这些支持物允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子，从而以更为自然的方式进行代谢。滤膜作为细胞培养介质来源于Grobstein(Nature,172:860-872;1953)关于后肾滤膜诱导的研究。经过长年对不同种类细胞的无数次应用，利用通透性支持物进行细胞培养被认为明显优于坚固的，不可透过的细胞生长界面。对于表皮细胞和其他种类的细胞，利用通透性支持物在体外培养使得细胞可以在更为自然的极性条件下生长和研究。同时提高了细胞的分化水平，使得体外生长的细胞在形态和功能上更为接近体内的细胞。还可以进行运输，吸收和分泌等细胞功能的研究，因为在通透性支持物上生长的细胞可以很方便且无干扰的接近其基底面和顶面的细胞膜结构。使用通透性支持物进行细胞培养对于实验细胞学研究是一个无可比拟的工具。选择合适的Transwell®膜和孔径Transwell通透性支持物可以提供三种膜材料：聚碳酯（PC），聚酯（PET）和胶原包被的聚四氟乙烯（PTFE）。表1提供了这些膜特性的更多信息。聚酯Transwell-透明嵌套的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处理，可以让细胞更好的贴附和生长。Transwell-透明嵌套使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态和单层细胞的形成。聚碳酯Transwell嵌套提供从0.1um到12.0um多种孔径。所有的膜都经过处理，使得细胞更易贴附。Transwell-COL嵌套湿润时透明的，胶原包被的PTFE膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。Transwell-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III型胶原。不同于传统包被技术会形成密封的膜层，康宁专利包被技术使具有生物稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的多孔性。选择孔径在实验中使用Transwell®通透性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的。表2总结了通透性支持物的常规应用和推荐使用的孔径。最小孔径的Tanswell膜（0.1um）主要应用于药物转导研究。细胞侵袭，趋化性和运动性研究通常采用3.0um或以上的孔径的Tranwell膜。细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系及培养条件有关，同时也与孔径相关。小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过。对于一些要求严格的实验，康宁建议在实验中选用一系列孔径作为对照来确定哪种尺寸最适合于你的细胞培养和特殊应用。还有一个方法就是参照已经发表的文献的推荐。若需更多的使用和应用信息，请访问康宁网站上技术信息部分的Transwell。总览03表1.Transwell膜特征化学兼容性孔密度选择合适的Transwell系统传统Transwell通透性支持物所有的Transwell膜都适用于组织学固定剂，包括甲醇和甲醛。聚酯Transwell膜具有最佳的全面化学适用性。这些膜（不包括聚苯乙烯）都耐受多种酒精，胺类，脂类，醚类，酮类，石油类和其他溶剂包括卤化碳氢化合物和DMSO，但是不推荐使用强酸强碱。在三类膜中只有胶原包被的PTFE膜没有确定的孔密度，因为它具有是曲折孔道的膜。两种具有额定孔密度的膜是聚酯膜和聚碳酯膜。聚酯Transwell膜的孔密度不像聚碳酯膜那么高，但是它具有更好的光学清晰度，康宁聚酯膜和聚碳酯膜的额定孔密度详见表3。Transwell嵌套可以提供四种膜直径6.5mm（24孔板），12mm（12孔板），24mm(6孔板)和75mm（100培养皿）。表4列出了这些尺寸可以提供的细胞生长面积。相对于每个规格，都有几种类型的膜和大范围的孔径可选择。具有专利的中心悬挂设计可以防止培养液由嵌套壁和孔壁之间通过毛细作用流失。悬挂设计使得嵌套与底部有1mm的差距，这样可以保证在嵌套移走的时候，形成的单层细胞不会被破坏。在嵌套壁上的缺口可保证与底部接触。传统的Transwell平板嵌套在6,12和24孔板及10cm培养皿中独立使用。HTSTranswell-24和HTSTranswell-96嵌套按特殊规格包装以方便操作和自动处理。Snapwell嵌套在扩散或Ussingchambers模型中使用。Transwell通透性支持物有三种基本设计：有关这些产品的详细信息可以在下面及订购信息中找到。75mmTranswell嵌套和100mm培养皿Snapwell嵌套设计与扩散或Ussing培养室配套使用特点光学特性细胞可见度组织培养处理膜厚度Matrix/ECM包被性胶原处理可提供孔径（um）聚酯（PET）透明好有10um有无0.4,1.0,3.0,8.0聚碳酯（PC）半透明较差有10um有无0.4,3.0,5.0,8.0聚四氟乙烯（PTFE）湿润时透明可见细胞轮廓无50um有有0.4,3.0总览04表2.通透性支持物应用选择表应用推荐孔径超大分子，离子，水，低分子量溶液，激素，生长因子等离子通道，酶，转运蛋白，受体，脂类的极性分布分类和定向靶点极性的形成和维持紧密连接的合成和装配蛋白转换膜循环生长因子，激素，抗体，病毒，毒素等受体-培体相互作用受体定位和药物反应极性药物对于血管通透性药物运输通过表皮（Caco-2细胞）和内皮屏障药物运输通过脑微血管内皮细胞肿瘤侵袭和转移克隆化检测侵袭抑制物细胞外支架作用噬菌作用血液中成形因子的趋药性与趋触性响应组织巨噬细胞的移动细胞-细胞相互作用细胞-底物相互作用肿瘤异质性细胞-细胞外支架相互作用饲养层-干细胞相互作用转导和渗透性研究细胞极性胞吞作用药物运输转移潜力和侵袭趋药性/动力研究共培养病毒，细菌和寄生虫对宿主细胞膜的附着入侵和透过内皮屏障微生物受体药物对微生物受体的效应微生物致病机理伤口愈合血管生成表皮再生炎症反应组织重建粒层细胞培养类固醇生成内分泌和旁分泌影响粒层分化，胚囊从透明层孵化，底物结合，滋养层细胞生长体外受精0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um5.0,8.0,12.0um3.0,5.0,8.0um0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um0.4,1.0,3.0um在Transwell聚碳酯膜上的巨噬细胞的扫描电镜照片（由B.Wetzel,S.Wahl,E.Westbrook和L.Altma,NIH,Bethesda,MD惠赠）总览05HTSTranswell系统HTSTranswell系统是24个或96个独立Transwell嵌套通过一个坚固的，可以由机械臂操作的支持物连接而成，从而可以作为一个单位来操作。这使得HTSTranswell系统成为自动操作系统，高通量药物运输(Caco-2细胞)和毒性研究的理想工具。HTSTranswell-96培养系统(U.S.PatentNo.6,943,009)包括以下几个部分：一个96孔嵌套板，可以选择1.0或8.0um孔径的聚酯膜，或者0.4um,3.0um,5.0um孔径的聚碳酯膜；带有可拆卸的培养液稳定装置的储液板用来加液或换液；检测使用的接收板（黑色或透明）；2个盖子，以防止挥发和污染。每个嵌套具有0.143cm2的生长面积。顶面及侧面的大开口便于添加和取样。HTSTranswell-24培养系统可以提供处理过的0.4um孔径及3.0um孔径的聚碳酯膜，或0.4um孔径的聚酯膜，具有对细胞贴附，生长和分化极佳的界面。一个一体化的储液板可以减少在培养过程中的液体处理操作（培养液可以一次性快速换掉）。一旦细胞层长满，HTSTranswell-24嵌套可以转移到一个普通的康宁®24孔培养板上进行实验。SnapwellTM嵌套Snapwell嵌套(U.S.PatentNo.5,272,083)是经过改良的Transwell嵌套，包括12mm的经组织培养处理的聚碳酯膜或透明的聚酯膜，以及一个分离环。这些嵌套主要用于运输和电生理研究。一旦细胞长满，分离环固定的膜可以拆卸，并垂直或水平放置，或置于Ussing培养室中。Ussing培养室可以通过哈佛仪器公司购买：®聚酯膜和聚碳酯膜的额定孔密度孔径0.4um1.0um3.0um5.0um8.0um聚酯膜1x108孔/cm2无2x106孔/cm24x105孔/cm21x105孔/cm2聚碳酯膜4x106孔/cm21.6x106孔/cm22x106孔/cm2无1x105孔/cm2额定孔密度*数据为额定值，可能有生产流程误差有所不同，为保证实验成功，我们推荐研究者确立自己的实验方法。表4.Transwell通透性支持物生长面积嵌套直径4.26mm6.5mm12mm24mm75mm多孔板和培养皿类型96well24well12well6well100mm培养皿嵌套膜生长面积0.143cm20.33cm21.12cm24.67cm244cm2*数据为额定值，可能有生产流程误差有所不同，为保证实验成功，我们推荐研究者确立自己的实验方法。HTSTranswell系统为机械操作而设计如何使用Transwell®通透性支持物06使用提示1.通透性支持物上的细胞形态和密度受滤膜孔径的影响。2.一些孔径大的膜可以容许细胞穿过。3.在通透性支持物上生长的细胞的贴附对于起始接种密度很敏感。初次使用应接种不同密度保证最佳生长。4.在培养之前将通透性支持物在培养基中孵育可以改善细胞得贴附和分布。5.与塑料培养表面一样，细胞在通透性支持物上仍然需要细胞外支架的包被。6.透明的Transwell是带有透明的，经组织培养处理的聚酯膜，细胞在相差显微镜下很容易被观察。7.Transwell-COL带有PTFE膜，经过等摩尔数的I型和III型牛胎盘胶原处理。从而形成了覆盖在滤膜纤维上的具有生物稳定性的胶原骨架。这些Transwell嵌套适用于需生物包被的细胞培养。常规使用指南1．使用时先将培养液加入多孔板的孔中，将嵌套放入，再将含细胞的培养液加入嵌套内部，推荐使用的培养液体积列在表5中。2．预先的平衡可以提高细胞的贴附效率。将培养液先加入多孔板中，再加入嵌套内。培养板放置于细胞培养的培养箱内至少一个小时，也可以过夜。接着加入含细胞的新鲜培养液，放回培养箱培养。3．定期检查培养液体积，并按需补加新鲜培养液。4．Transwell嵌套有三个开口以便于用枪头从下部添加或取用样品。5．单细胞层可以用基本细胞学方法在Transwell嵌套中直接固定和染色。避免使用可以溶解聚苯乙烯，聚酯，聚碳酯等膜材料的溶剂。可以在多孔板的孔中放置一系列所需溶剂，将Transwell嵌套依次浸泡而完成固定和染色的过程。在康宁生命科学的网址上可以找到Transwell嵌套固定和染色的实验操作程序。嵌套的多孔底部使研究者可以从上层或下层接触到细胞，从而为体外的细胞运输和其他代谢活性研究提供通用的工具。下部空间Transwell®嵌套上部空间多孔膜首先将培养液加入培