Tricine小分子蛋白电泳流程

Tricine-SDS-PAGE电泳流程一、实验准备1、试剂尿素（Urea）、β-巯基乙醇（BME）、过硫酸铵（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、三羟甲基氨基甘氨酸（Tricine）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）。2、溶液配制（1）正极缓冲液（10×）：2MTris，pH8.9；（2）负极缓冲液（10×）：1MTris，1MTricine，1%SDS；（3）凝胶缓冲液（3×）：3MTris，0.3%SDS，pH8.45；（4）3C丙烯酰胺储存液：48%Acr，1.5%Bis；（5）5C丙烯酰胺储存液：47%Acr，2.5%Bis；（6）36.5%Urea；（7）10%AP；（8）TEMED；（9）75%C2H5OH；（10）H2O。二、实验步骤1、不同组成的丙烯酰胺溶液的配制Tricine-SDS-PAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4%的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10%的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16.5%的丙烯酰胺溶液（添加或不添加36.5%尿素）聚合而成。凝胶配方如下表所示（制备1块厚度为1mm的凝胶需要添加的各溶液的体积）。不同的丙烯酰胺溶液的组成（单位：mL）组分致密胶夹层胶浓缩胶凝胶缓冲液（3×）1.0000.5000.6003C丙烯酰胺储存液00.5000.1255C丙烯酰胺储存液1.0000036.5%Urea1.0800010%AP0.0100.0100.010TEMED0.0010.0010.001H2O00.4891.0642、灌胶凝胶制作采用三层不连续胶的结构，由致密胶+夹层胶+浓缩胶构成。各种丙烯酰胺溶液分别加入10μL的10%AP和1μL的TEMED混匀后，随即灌胶，先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。3、上样取10μL的蛋白质标准品，沸水浴使蛋白质与SDS结合变性，小心点入凝胶的上样孔中。4、电泳内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入正极电泳缓冲液，形成Tricine-SDS-PAGE电泳系统，用20mA恒流电泳3h。考马斯亮蓝染色后，用甘油溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。