层析(包括：吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等)

生命科学学院：陈晓明(C)2009层析技术（chromatography）生命科学学院：陈晓明(C)2009一、简介1、层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。生命科学学院：陈晓明(C)20092、层析法是目前广泛应用的一种分离技术，是分离各种生物大分子的主要手段之一，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。3、40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们首先提出了色谱塔板理论，获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。生命科学学院：陈晓明(C)20094、按照不同的标准层析法有不同的分类。根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。生命科学学院：陈晓明(C)20095、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。6、在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法等生命科学学院：陈晓明(C)2009生命科学学院：陈晓明(C)2009二、原理及概念层析技术是一类物理分离方法,根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,由于各组分随流动相前进的速度不同,从而得到有效分离。生命科学学院：陈晓明(C)2009例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。生命科学学院：陈晓明(C)2009层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。生命科学学院：陈晓明(C)2009基本概念固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。生命科学学院：陈晓明(C)2009分配系数（distributioncoefficient）分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力），某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据，常用K来表示msccKCs:溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度生命科学学院：陈晓明(C)2009K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程中溶质出现较晚K值小表示某溶质在流动相中浓度大，故在洗脱液中出现较早有相似的K值，则表明两组分层析峰会发生重叠，分离效果差生命科学学院：陈晓明(C)2009分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质②固定相和流动相的性质③层析柱的温度。生命科学学院：陈晓明(C)2009不同的层析机理，其K值函义不同:吸附层析中K值表示吸附平衡常数分配层析中K值表示分配系数离子交换层析中K表示交换常数亲和层析中K表示亲和常数。生命科学学院：陈晓明(C)2009迁移率（Rf或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示迁移率实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。常用Rx来表示生命科学学院：陈晓明(C)2009分配系数与迁移率的关系K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。生命科学学院：陈晓明(C)2009操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。数值大，结合力强。膨胀度（Vβ)：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的床体积。床体积（Vt)生命科学学院：陈晓明(C)2009三、分类1、按两相所处状态分类流动相液体气体液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法生命科学学院：陈晓明(C)20092、按层析原理分类名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离生命科学学院：陈晓明(C)20093、按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离生命科学学院：陈晓明(C)2009凝胶层析（gelchromatography）凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）分子筛层析（molecularsievechromatography）凝胶过滤（gelfiltration）凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）生命科学学院：陈晓明(C)2009凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。生命科学学院：陈晓明(C)2009葡聚糖凝胶（dextran）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）琼脂糖凝胶（agarose）SephacrylSuperdex聚苯乙烯凝胶一、凝胶的种类和性质生命科学学院：陈晓明(C)20091.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex）是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。生命科学学院：陈晓明(C)2009G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环氧丙烷（见下式）为交联剂将链壮结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物,交联度由环氧氯丙烷的百分比控制生命科学学院：陈晓明(C)2009葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表持水量（吸水率）乘以10（单位是mL/g干胶）,如G-25表示1g干胶持水2.5mL，吸水率是2.5mL/g干胶；G-100表示1g干胶持水10mL，依次类推。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。生命科学学院：陈晓明(C)20092.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶生命科学学院：陈晓明(C)2009像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-GelP-2至Bio-Ge1P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算），所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。生命科学学院：陈晓明(C)2009琼脂糖凝胶（Sepharose）琼脂糖凝胶（agarosegel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒