测序技术介绍

测序技术介绍测序技术发展史一代测序1954年，Whitfeld等用化学降解法测定多聚核糖核苷酸序列，是关于DNA测序技术的较早报道。1977年，Sanger发明DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert发明DNA化学降解测序法(chemicaldegradationsequencing)，2项技术的出现，标志第1代测序技术诞生。Sanger测序法的原理每一次DNA测序反应都由4个独立反应组成；由于DNA双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测序过程中掺入2′，3′-双脱氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），当ddNTP位于DNA双链的延伸末端时，无羟基3′端不能与其他脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键，因此，DNA双链合成便终止；若在终止位点掺入ddATP，则新生链末端为A，若掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相应地，新生链末端则是T、C或G。该测序技术的具体做法如下：将模板、引物、4种dNTP（其中含有一种为放射性同位素标记的核苷酸）与DNA聚合酶共同保温，形成的混合物包含许多长短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）分离该混合物，得到放射性同位素自显影条带图谱，人们依据凝胶电泳图即可读出DNA双链的碱基序列组成。自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。测序过程中的常见问题分析在进行DNA测序时，紧接引物的10—30Bases有时不一定能完全读清楚。由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：1：测序结果有很多套峰，出现很多N值原因分析：PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。模版本身含杂合序列，有等位基因。测序过程中的常见问题分析2：为什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作为测序引物，所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。3：测序结果和文献资料不一样，为什么?原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序,那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。测序过程中的常见问题分析5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA，就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰，我们只需认定样品此处碱基为T为行了。第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G），如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。测序过程中的常见问题分析6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象?下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。测序过程中的常见问题分析7：poly结构的测序结果以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。第二代测序技术（Next-GenerationSequencing）各自的优点454测序平台得到的片段能够达到400bp，并且读长的质量高；Solexa测序平台的性价比最高，在数据量相同的情况下，测序成本仅为454测序平台的1/10；SOLiD测序平台准确度能够达到99.94%，在片段覆盖率为15×时，测序准确度可接近100%。2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（basepair），且准确率达到99%以上。2008年，GSFLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（denovo）和宏基因组测序（metagenome）方面有着不可替代的地位。2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——GenomeAnalyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNAcluster）、桥式PCR（BridgePCR）和可逆阻断（Reversibleterminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1GbAnalyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GAIIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全称是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。2019/10/6454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理2019/10/6454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理2019/10/6454测序原理焦磷酸测序法（Pyrosequencing)的原理2019/10/6454测序原理在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：•样品处理•文库制备•emPCR•反应板准备•上机测序2019/10/6454测序原理1.样品处理：样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。2019/10/6454测序原理2.文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。2019/10/6454测序原理3.emPCR（乳液PCR)是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段依然结合在磁珠上。2019/10/6454测序原理4.454测序的反应板称为PTP（PicoTiterPlate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。2019/10/6454测序原理5.测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。2019/10/62019/10/6454测序原理优缺点：•454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上；•主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。•目前，由于454测序仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（denovo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。Solexa测序2019/10/6Solexa测序2019/10/6常用术语：SBS：边合成边测序反应，每次SBS会延伸一个碱基，大约耗时70分钟。Run：单次上机测序反应，可以产生4G-75G测序通量不等。Lane：单泳道，每条泳道可以直接物理区分测序样品，1次run最多可以同时上样8条Lane。Chan