实验四、基因组DNA的提取和检测(阳成伟)

实验四、基因组DNA的提取准备：一次性手套、65℃水浴锅、氯仿、无水乙醇、1.5离心管、菜花实验目的：1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理。2.了解基因组DNA的实验用途。3.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。•材料：花椰菜/昆虫组织•设备：移液器，高速离心机，水浴锅，培养箱。•试剂：1.CTAB组织消化液2.氯仿3.无水乙醇4.TE缓冲液CTAB溶液配制•2%CTAB溶液：100mmol/LTris-HCl,pH7.0；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA；2%CTAB.10mlfinalconc.（终浓度）CTAB0.2g2%H2O5.78ml1MTris-HCl1.0ml100mM5MNaCl2.8ml1.4M0.5MEDTA0.4ml20mM实验原理（CTAB法）•CTAB，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可使细胞破裂，释放出核酸；•CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解释放出来的DNA（DNA在2mol/LNaCl中DNA具有较高的溶解度）；•加入无水乙醇，可以使DNA从溶液中沉淀出来。实验步骤（常温操作，2人一组）1.取适量(300-500mg)植物组织，加入2mlCTAB抽提缓冲液，充分匀浆2-3min，然后每人转移700ul的匀浆液至一支1.5ml离心管中，65℃水浴45min（中间摇动2-3次）（裂解细胞，释放核酸和蛋白）；2.加入700ul的氯仿，上下摇动2-3min(此步是萃取组织液中的蛋白质；务必带上手套！）；3.12000rpm离心10min，取400ul上清液转移至一支1.5ml离心管中（由于此时悬液已经分层，而我们需要取最上层的溶液，所以注意千万不要使枪头触碰到中间的杂质层，当然，更不能取吸取下层的萃取液了）；4.加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下颠倒3-4次混匀；然后再加入2倍体积的无水乙醇（0.9ml)，上下颠倒3-4次混匀（如DNA量大，此时可见絮状DNA沉淀。（如果放置于-20度过夜，DNA产率会更多！）5.12000rpm离心5min，缓缓倒掉上清液（剩余的液体可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（无色透明胶状物！）；6.加入200ulTE缓冲液（含50ug/mlRNase），轻弹管底，以溶解DNA；也可以用枪头缓慢地来回吸放液体来帮助溶解DNA。此时应该可以看到片状的DNA沉淀物逐渐变少，最终消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否则影响电泳效果！）；7.将DNA溶液置于37℃培养箱或水浴中30min（降解残留的RNA）；8.-20℃保存备用。9.取5~10ulDNA（加适量loadingbuffer）电泳检测；取2ulDNA测定浓度和OD260/280（下次课电泳检测）。基因组DNA的检验（纯度）紫外分光光度法：核酸在260nm处有最大吸收峰蛋白质在280nm处有最大吸收峰盐和小分子在230nm处有最大吸收峰1.7OD260/OD2801.9OD260/OD2302.0基因组DNA的检验（完整性）凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。M123456M123456123456材料质量（mg）100300500100300500所加TE体积（ul）200200200400400400260/2802.031.971.922.072.022.01260/2302.102.312.192.051.952.02浓度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0上样2ul上样8ul注：1-6序号分别与表中对应。核酸的贮存——DNA保存1）短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液(PH为8.0)，可减少DNA脱氨反应；EDTA可以抑制DNase的活性。2）长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，减少分子间的排斥力，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，基因组DNA提取的用途•构建基因组文库•Southern杂交•RFLP•基因克隆（PCR）下次课程•质粒DNA的提取及质量检测