第9章-发酵液预处理和固液分离

第九章发酵液的预处理和液-固分离关海燕[e-mail]生命科学技术学院发酵工程教研室2预处理和固液分离内容固液分离发酵液胞外上清液/滤液预处理提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞3发酵液的预处理（Pretreatment）以细胞培养液或发酵液为出发点，设法使目标产物转移到液相中，同时除去其它悬浮颗粒以及改善滤液性状，利于后续操作，该过程称为预处理。4为何要对发酵液进行预处理？发酵产物浓度较低;悬浮物颗粒小;可压缩性;液相粘度大；悬浮状态稳定5预处理的目的目的：改变发酵液的理化性质，利于固液分离的进行。高价无机离子和可溶性蛋白。针对对象：6一、确定预处理方法的基本条件了解抗生素存在的部位稳定性提取工艺对滤液质量的要求7二、预处理的方法凝聚和絮凝Coagulationandflocculation降低发酵液粘度Reduceviscosity调节悬浮液的pH值RegulationofpH杂蛋白的去除Removalofuselessprotein高价无机离子的去除Removalofinorganicion助滤剂Filteraids和反应剂Reactant8凝聚：指在中性盐（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。指絮凝剂基于架桥的作用将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。絮凝：（一）凝聚和絮凝9机理：1）中和粒子表面电荷2）消除双电层结构3）破坏水化膜凝聚Coagulation10两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。胶体双电层结构11凝聚价或凝聚值使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L），称为凝聚价或凝聚值。表示电解质的凝聚能力12Schulze－Hardy法则：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力次序为Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+13常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO314絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程。机理：架桥作用分类：阴离子型、阳离子型、非离子型絮凝flocculation15高分子絮凝剂的吸附架桥作用它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。16混凝在料液中，先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，而后再加入絮凝剂的操作过程。提高温度方法加水稀释－确保目的产物稳定性－过滤速度需提高稀释倍数以上（二）降低发酵液的粘度18调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。影响离子型絮凝剂的电离度。（三）调节pH19沉淀法变性法吸附法（四）去除杂蛋白201.杂蛋白去除-沉淀法A.等电点沉淀法B.酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀212.杂蛋白去除-变性加热大幅度调节pH值加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。223.杂蛋白去除-吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质;在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠形成沉淀物，该沉淀物不仅能吸附杂蛋白和菌体等胶状悬浮物，加快了过滤速度。231.Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀2.Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁3.Fe2+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀（五）去除高价无机离子24工业生产中有时需要加入某种固体物质，以加快过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂。例如硅藻土、淀粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素、白垩土等。（六）加入助滤剂和反应剂25助滤剂应具备的条件(1)无毒，惰性，对抗生素无吸附作用；(2)有一定细度及硬度，不可压缩；(3)来源方便，成本低廉。26加入反应剂1）与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀;2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶转化为单糖，提高过滤速率。27•收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相；•收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物。三、固液分离（一）固液分离分目的：28（二）影响发酵液固液分离的因素•1）发酵液中悬浮离子的大小292）发酵液的黏度：菌体的种类和浓度（重要因素）培养液中蛋白质、核酸大量存在培养基成分某些染菌发酵液发酵过程的不正常处理30常见的固液分离方法•过滤filtration•离心Centrifugation•膜分离membraneseparation•双水相萃取ATPS•扩张床吸附EBA31（一）过滤filtration借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。32过滤推动力：•悬浮液自身压强差、重力•悬浮液表面加压•过滤介质下方抽真空•离心力过滤阻力：•介质阻力•滤饼阻力33过滤介质：•使固-液混合料液得以分离的某一界面，通常指滤布或膜过滤中所用的膜。过滤介质要求能耐酸碱、耐高温、耐化学试剂，抗拉性能好，有一定的机械强度和孔隙度。•滤布材料——法兰绒、帆布、斜纹布、白细布及一些合成纤维•膜材料——醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚酰胺、聚丙烯等341）实验室用抽滤装置3、固液分离过滤设备352）板框压滤机•适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。36板框压滤机•包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。板框过滤机动画383）真空转鼓过滤机主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒，表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿径向被筋板分隔成若干个空间。转筒真空过滤机动画40转筒真空过滤机主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。41带式真空过滤机•带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。42带式真空过滤机流程•1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连续进行。2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速，对不同物料有广泛的适应性。•3、在同一设备上可采用多次逆流洗涤得到高浓度的滤液，也可采用并流洗涤或顺流洗涤获得高纯度的滤饼。43结构：转鼓滤饼滤布滤网离心过滤机工作原理图转鼓(上有小孔，亦称悬框)；滤网；滤布；机架。原理：由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。4）离心过滤机44又称切向流过滤在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。5）错流过滤45设备主要结构过程特点适用性板框压滤机滤板/滤框/夹紧机构/机架装合过滤洗涤卸渣整理加压过滤，推动力较大；结构简单，造价低；过滤面积大，能耗少；间歇操作；洗涤时间长，生产效率低。应用广泛。对原料的适应性强。转鼓真空过滤机转筒(滤网、滤布)/分配头、滤浆槽过滤洗涤吹干卸渣连续化生产，自动化程度高；真空过滤，推动力较小；滤饼湿度大，设备投资高。适于粒度中等，粘度不太大的物料。离心过滤机转鼓(滤网、滤布)/机架过滤洗涤卸渣离心过滤，推动力最大；滤液湿度小，设备成本高，应用广泛，过滤面积小。几种过滤设备的比较46（二）离心分离•基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。离心机的种类与用途低速离心机：高速离心机：超速离心机：其最大转速在8000r/min以内，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。最大转速为（1～2.5）×104r/min，主要用于细胞碎片和细胞器等较小固形物的分离。最大转速达(2.5～12)×104r/min，主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化。4748按离心机的作用方式：–斜角式–平抛式–管式–碟式离心机的种类与用途491）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机；指离心管腔与转轴成一定倾角的转子。502）平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。51３）管式离心机•管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，转鼓内装有纵向平板，•其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口。52用于分离各种浮浊液，进行液-液分离，如油脂；534）碟片式离心机•是生物工业中应用最为广泛的一种离心机。•有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60~100゜锥形碟片。•碟片间的距离一般为0.5-2.5mm。54三、全发酵液提取•一种新型的生物分离技术概念被提出：集成化分离技术，即对已有的两种或两种以上的单元操作进行有效的组合，组成一种有效的单元操作，以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的。•1.用膜技术进行全发酵液提取•2.用双水相萃取进行全发酵液提取•3.用扩张床吸附进行全发酵液提取55•扩张床亦称膨胀床是发展中的吸附分离技术。•九十年代初，英国剑桥大学的H.A.Chase等通过对吸附剂的改进及对层析柱和流体分布器的精心设计，得到了稳定、返混小的扩张床。扩张床吸附技术Expandedbedadsorption吸附介质颗粒在向上流动的上清作用下扩张起来，上清中的目标蛋白被吸附于介质上，而细胞及碎片通过柱子而流出，而洗脱目标蛋白时从反方向将吸附介质压紧，再用洗脱液将目标蛋白洗下来。操作分为五个部分:(1)平衡(equlibration)、(2)吸附(adsorption)、(3)冲洗(washing)、(4)洗脱(elution)和(5)再生（regeneration)。57扩张床吸附技术•扩张床吸附集澄清、浓缩和初步纯化于一体的分离纯化技术。•可以减少离心或过滤等单元操作步骤，节约操作周期。提高目标产物的收率，降低了分离纯化的成本，•被称为近几十年来出现的第一个新的单元操作。随着商业化吸附剂和装置的出现，愈来愈多地引起人们的兴趣和关注。58思考题１发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？２凝集与絮凝过程有何区别？３固液分离的方法有哪些？