血红蛋白的分离和提取

课题3血红蛋白的提取和分离一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，理解色谱法、电泳法二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填思考：“课题1--DNA的粗提取与鉴定”实验理想的材料是什么？“课题3--血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。一、基础知识：（一）蛋白质分离原理（二）蛋白质分离的方法1）凝胶色谱法：又称分配色谱法2）电泳法（三）缓冲液的作用二、实验操作－－实验步骤血液组成成分（1）洗涤红细胞（2）释放血红蛋白（3）分离血红蛋白（4）透析血红蛋白1、样品处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化注意事项蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力1.凝胶色谱法一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子筛）根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法（2）概念：（1）凝胶3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快总结：大分子经过路程短，流动快；小分子经过路程长，流动慢。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子4、具体过程2．凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量SDS带负电荷多的，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂（1）作用：（2）配制：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。血液组成成分阅读思考：1.血液由______和________两部分组成。2.血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。3.该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链亚铁血红素1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？目的分析：1.蒸馏水的作用是______________________________。2.加入甲苯的作用是____________________________。3.充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质纯化－－凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱注意：（1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样4.洗脱5.收集缓冲液凝胶注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。3.再调液面1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱、5.收集注意事项1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A、相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B、相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C、相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D、二者根本无法比较练习巩固2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷AC5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）•A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞•C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面