外源基因的原核表达

2019/10/812019/10/82外源基因表达的作用：外源基因表达泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋白质的结构与功能的重要方法，也是制备和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可少的手段。通过外源基因的表达可由宿主细胞产生大量的目的蛋白。2019/10/83常用的原核外源表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统2019/10/84原核生物基因表达系统的特点：1、原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。2、基因组结构简单，便于基因操作和分析。3、多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。2019/10/85原核生物基因表达系统的特点：4、不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。由于以上特点，近年来真核生物表达系统发展很快，并构建了相应的基因表达载体。2019/10/86大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最为广泛的经典表达系统。属革兰氏阴性细菌。其特点是：遗传背景清楚目的基因表达水平高培养时间短2019/10/87大肠杆菌表达系统的主要不足•1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程。•2、表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性•3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。2019/10/88大肠杆菌基因表达载体理想的大肠杆菌表达载体的特征1、稳定的遗传和复制能力，在无选择压力下保存于大肠杆菌细胞内2、具有显性的转化筛选标记3、转录可以调控，抑制时本底转录水平较低4、转录的mRNA能够在适当的位置终止且转录不影响载体的复制5、具备适用于外源基因插入酶切位点2019/10/89大肠杆菌基因表达载体构成1、复制子：是一段包含起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。其功能是通过复制使载体稳定存在于大肠杆菌细胞。2019/10/810大肠杆菌基因表达载体2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后，仅有少数细菌能获得携带外源基因的质粒并稳定地传代，筛选标记可有效地筛选出转化有外源基因的阳性重组。2019/10/811大肠杆菌基因表达载体3、启动子：是与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列。启动子是调控外源基因转录的重要顺式作用元件，与mRNA的合成有很大关系，是表达载体不可缺少的元件。2019/10/812大肠杆菌基因表达载体4、终止子：在转录过程中能在特异位点将转录终止的DNA序列。有两种类型1、ρ－因子型终止子2、转录产物二级结构2019/10/8132019/10/814大肠杆菌基因表达载体4、终止子：能在特异位点终止转录的DNA序列。终止子有两种类型1、ρ－因子2、转录产物二级结构2019/10/8152019/10/8162019/10/817终止子的功能（1）、能能有效控制目的基因mRNA的长度（2）、提高mRNA的稳定性（3）、避免载体上其他基因的异常表达2019/10/818大肠杆菌基因表达载体5、核糖体结合位点：原核细胞mRNA蛋白合成起始点上游的一段非编码序列。能与30S小亚基中16SrRNA3’末端的一段序列特异结合。此序列富含嘌呤，核心序列为SD序列。2019/10/819大肠杆菌基因表达载体6、密码子：密码子有简并性，多个密码子为一个氨基酸进行编码，不同生物在利用这些密码子时其利用频率不同，不同的密码子会影响到大肠杆菌的翻译速度。2019/10/820基因表达的机制基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构件建了不同类型的表达系统，可根据需要合理地选择适当的表达系统。外源基因在受体细胞中的表达包括：1、转录2、翻译两个环节2019/10/821基因表达的机制基因工程的核心问题：有效表达外源基因表达的关键步骤：起始转录基因表达的限速步骤：转录起始的速率构建表达系统时首先要考虑的问题是：1、选择可调控的启动子2、相关的调控序列2019/10/822目的：在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖到一定的密度时，在某种特定的诱导因子的诱导下启动转录合成mRNA。启动子原核生物启动子真核生物启动子诱导型诱导型组成型组成型2019/10/823mRNA的延伸与稳定性：有效表达的关键是：保持mRNA的1、有效延伸2、正确终止3、mRNA在细胞中的稳定存在2019/10/824mRNA的有效延伸：导致mRNA转录提前终止的可能原因有和解决办法1、衰减子：类似于简单的终止子，在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建表达载体时应避免该序列的存在。2019/10/8252、非特异终止：防止非特异性终止的方法是在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。2019/10/826转录的正确终止也是外源基因有效表达的重要因素，可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。原核生物解决办法真核生物解决办法2019/10/827mRNA在细胞中的稳定存在：mRNA在受体细胞中的稳定存在直接决定翻译产物的多少。解决办法1、原核生物：选择一个RNase缺失的工程菌株。2、真核生物：提高mRNA的正确加工2019/10/828外源基因mRNA的有效翻译为使外源基因有效翻译，在构建表达体系时应考虑以下问题：1、AUG为首选起始密码子2、SD序列为与核糖体结合位点3、SD序列与起始密码子之间的距离为3～9个碱基4、在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构5、选择合适的终止密码子2019/10/829表达蛋白在细胞中的稳定性常用的措施有：1、构建融合蛋白表达系统2、构建分泌蛋白表达系统3、构建包涵体表达系统4、选择蛋白水解酶基因缺陷受体系统2019/10/830外源基因在大肠杆菌中表达产物在细胞的位置：外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。其表达形式包括形成：1、不溶性蛋白2、可溶性蛋白2019/10/831大肠杆菌载体的表达方式非融合表达载体融合表达载体带纯化标签表达载体分泌型表达载体表面展示表达载体带分子伴侣表达载体2019/10/8321、非融合表达载体：应用此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫原性等方面基本或完全一致。目前上市的细胞因子类产品多采用此类表达载体。2、融合表达载体：分子量较小的蛋白质常用此类载体进行表达。将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。2019/10/833在进行融合表达时，一般将受体菌蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋白的方式表达后其稳定性大大增加。其原因为：外源小分子蛋白上的酶切位点暴露于分子的表面。当以融合蛋白的形式表达后，外源蛋白部分在菌体自身蛋白的引导下正确折叠，可最大程度上封闭酶切位点。2019/10/834带纯化标签的表达载体：载体上具有一段特殊序列，该序列表达后可作为纯化标签。目的基因与该序列融合表达后，用亲和层析的方法很方便的将目的蛋白分离，切除标签序列后可得到纯化的目的蛋白。2019/10/835分泌型表达载体：将目的基因与信号肽融合表达，表达蛋白在信号肽的引导下成为分泌蛋白。表面展示载体：将目的基因克隆到细菌表面蛋白的结构基因中，从而达到细菌表面表达。带分子伴侣的表达载体：2019/10/8362019/10/8372019/10/8382019/10/839宿主菌大肠杆菌表达系统表达的基因一般都是异源基因，甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量的异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因有：1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统；2019/10/8402、大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；3、大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。由于以上原因，为使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的工程菌株。2019/10/841常见的大肠杆菌表达系统•Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。通过对大肠杆菌tacI基因诱变，获得能过量表达lacI阻遏蛋白的基因突变体lacIq，使外源基因的表达调控在一定的水平。此外，目前还构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lacIq(ts)宿主菌和载体，使lac和tac启动子的转录受温度的控制，在低温(30oC)下基因的转录受到抑制，在(42oC)下基因的转录保持开放。2019/10/842常见的大肠杆菌表达系统•PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或溶原循环。λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时，选用温度敏感突变体cl1857(ts)的基因产物调控PL和PR启动子的转录。2019/10/843常见的大肠杆菌表达系统•T7表达体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的，具有很高表达能力的表达系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，这是一种活性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进行高表达。2019/10/844常见的大肠杆菌基因表达受体菌株菌株基因型启动子BL21hsdSgalT7噬菌体HMS174recA1hsdRrifT7噬菌体M5279lacZtrpArpsLλ噬菌体PLRB791W3110lacIqL8lac,tac2019/10/845大肠杆菌高效表达目的基因策略对表达相关元件进行优化提高稀有密码子tRNA的表达作用提高外源基因表达产物的稳定性优化发酵过程提高外源基因mRNA的稳定性2019/10/846表达相关元件的优化主要包括与表达相关的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列。具体方法为组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基序列；调整SD序列与起始密码ATG之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成发卡结构。2019/10/847表达质粒的优化和设计构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。2019/10/848核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3～6倍翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6～8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5～7个碱基长度ATG与UAAGGAGG至少相隔3～4个碱基，与AAGAA至少相隔5个碱基；mRNA的翻译才能进行ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。2019/10/849核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明讨mRNA5’端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。2019/10/850尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5’端的“茎环”结构。2019/10/851把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下20