WHO人类精液检查与处理实验手册

WHO人类精液检查与处理实验手册（第五版）修订要点及临床应用背景1980年出版第一版“人类精液及精子—宫颈精液实验实检验手册”（生育调节）1987年出版第二版（生育调节、不育症的诊治）1992年出版第三版（生育调节、不育症的诊治、环境污染）1999年出版第四版（男用避孕病、辅助生育技术-ICSI、环境污染）背景以往精液分析存在问题：检测方法不一结果带有主观性、不客观、不真实精确度低、重复性差对男性生育力的评估、临床诊断应用价值很有限因此，需要一个标准化的手册2010年出版第五版随着近年来男科学和生殖医学的快速发展，基于询证医学的证据，不少原有的概念和诊疗建议需要修订；为此，WHO组织成立了专门的委员会来负责这项工作，编写制订了新一版的手册，以期达到更好的标准化，提高精液分析的质量。修改WHO人类精液检查手册的目的提高精液分析各参数的准确性简化方法，提高可操作性提供质控结果不良时的应对提示及细节利于实验室间的标准化提高精液分析各参数的临床应用价值（结果判断评述）提高疗效评估的准确性第5版《手册》提纲一、精液分析标准程序：常规分析、抗体包被精子、非精子成分；可供选择的试验：精子多发性缺陷指数、白细胞免疫细胞化学染色、精子宫颈粘液相互作用、精桨生化、CASA；研究试验：活性氧、顶体反应、精子卵细胞相互作用作用、精子透明带结合、去透明带仓鼠卵穿透试验、精子染色质检测等。“精液分析”部分的修订主要涉及：精子浓度和精子总数的测定；精子活动力分级；精子形态学评估；精液参考值范围。精子浓度和精子总数的测定简化精液稀释方法及增加计数池的面积，每份标本均采用两次取样、两次稀释和两次计数，每次计数至少200个精子，且两次计数在95%可信区间内。一次射精中的精子总数能够提供反映睾丸功能的更为精确的信息，因此，新版手册强调必须精确地测定精液体积。精液采集和体积测定根据重量间接计算精液体积，假定精液比重为1g/ml（实际为1.014g/ml)来计算。（首选方法）1.秤取容器的重量，2.秤取装有精液的容器的重量，3.计算重量之差（g=ml)精子浓度和精子总数的测定推荐使用改良Neubauer血细胞计数板；制备两份分别稀释的样本；不将同一份稀释样本加入到两个计数池中；不要两次计数同一个数池。精子数低的样本：不必精确测定时粗略估计如果4/X400HPF(或16/X200HPF)，则说明浓度为“2x106/ml”存在精子吗？取1ml精液，离心300gx15min;弃上清，留下50∪l液体，取2份10∪l沉淀加于载片，分别加盖22mmx22mm盖片（20∪m深）；观察整个盖片（2x480个视野）；如果有精子，则为“隐匿精子症”。存在活动精子吗？将40∪l精液置于24mmx50mm盖片下（33∪m深）；观察整个盖片（～1200视野）；如果见到活动精子，则计数有多少。注意：以上过程并不精确少的精子=大的计数误差未见精子≠没有精子存在；0的95%可信区间上限=3.7精子活动力检测精子前向运动的情况与受孕具有密切的关联；新版手册中一个重要的修订是精子活动力的分类方法。精子活动力的分类前向运动（Progressivemotility,PR)非前向运动（Non-progressivemotility,NP)不运动（Immotility,IM)精子形态学：染色方法推荐采用Papanicolaou、Shorr或Diff-Quik染色法使用光学显微镜观察，精子头部顶体区为浅蓝色，顶体后区为深蓝色，中段略呈红色，尾部为蓝色或红色。残余的胞浆小滴染成粉红色或橙红色。精液的参考值范围新版手册对正常生育男性额精液参考值范围进行了修订。为了制订参考值范围，采纳了3大洲8个国家的400～1900分最近使女方生育的男性的精液标本的原始数据。在数据统计方面，由于各项精液参数的高值都不太可能对生育产生危害，所以采用单侧参考值区间，并以第5百分位数作为参考值下限对于精液常规分析参数来说更为合适，而不需要像一般的统计学分析那样采用双侧参考值区间和第2.5百分位数。新版手册制定的参考值范围WHO版本2345年1987199219992010参考值正常正常参考百分位数55095精液量.（ml)2.02.02.01.53.76.8总数（m)40404039255802精子深度（M/ml)2020201573213前向运动（%）505050325572存活（%）507575587991正常形态（%）5030（15）41544新版手册制订的参考值范围参数参考值下限精液体积（ml)1.5（1.+1.7）精子总数(106/次射精）39（33-46）精子深度(106/ml)15（12-16）总活动率（PR+NP,%)40（38-42）前向活动率(PR,%)32（31-34）存活率（存活精子。%）58（55-63）精子形态学（正常形态，%）4（3.0-4.0）其它参数PH≧7.2过氧化物酶阳性白细胞（106/ml)1.0MAR试验（附着粒上的活动精子，%）50免疫珠试验（附着珠上的活动精子，%）50精浆锌（∪mol/射精）≧2.4精浆果糖（∪mol/射精）≧13精浆中性葡糖苷本酶（mU射精）≧20精液分析参数的临床应用生育力评估：女方妊娠、妊娠时相明确不育诊断，寻找病因其他男性病诊断治疗策略制定（常规治疗及辅助生殖）疗效评估避孕节育效果评估生育力评估评估男性生育三大要点：女方妊娠妊娠时相精液参数其他男性病诊断精子的总数：睾丸生殖功能输精管道的通畅程度血精、脓精：附性腺疾病精浆生化：附性腺功能治疗策略制定（常规治疗及辅助生殖）少精子症的分类和ART治疗方案精子浓度治疗轻度少精子症≧10，20(15)×106/mlIUI中度少精子症≧5，10×106/mlIUI/IVF严重少精子症≧1，5×106/mlIVF/ICSI极度少精子症1×106/mlICSI引用WHO指南治疗策略制定（常规治疗及辅助生殖）弱精子症的分类和ART治疗方案精子活力（a+b)治疗轻度弱精子症≧30(20)%IUI50(32)%中度弱精子症≧10%,30(20)%IUI/IVF严重弱精子症≧1，10%IVF/ICS极度弱精子症1%ICSI或死精子症引用WHO指南治疗策略制定（常规治疗及辅助生殖）畸形精子症的分类和ART治疗方案精子正常形态率治疗轻度畸形精子症≧10(3)%IUI5(4)%中度畸形精子症≧5（2）%,10(3)%IUI/IVF严重畸形精子症≧1，5（2）%IVF/ICS极度畸形精子症1%ICSI引用WHO指南精子形态与功能常用检测方法国家人口计生委科研所世界卫生组织生殖合作研究中心谷翊群背景：不育症发病率各国报道不尽相同，WHO研究如果表明：发达国家发病率约在5%-8%，发展中国家亚洲和中东地区发生率较低，约3%-4.8%，发病率高的是非洲国家，高达10%-30%，我国患病率约为1-5%按8%计算，全世界约有5000-8000万人有生育问题，每年新增200万对不育夫妇，而且这数目还在增加，在不育夫妇中，男性生殖能力异常的约占50%男性生育力的判断缺乏金标准精液常规分析是临床诊疗男性不育症的最常用、最简便、直观的辅助检查及判断男性生育力的实验室指标。临床研究资料显示，精液中的精子密度。精子活力及活精子数与自然妊娠率有着明确的统计学上的相关性。但是对精液常规检查结果正常或接近正常的不育病人缺乏有效、简便快速的检测方法。精液常规检查的项目包括精液量、PH、精子密度、精子活力、精子存活率及精子形态学。这些指标参数只是在一定程度上反映出达到自然妊娠所要求的最低精子质量，不能反映精子功能及顶体激活、顶体反应、精卵识别及受精过程诸多环节中是否功能正常。因此，有必要建立或选用特殊实验对精子功能进行测定。精子存活率精子形态分析精子顶体完整性精子与透明带结合试验精子细胞核成熟度与DHA损伤检测精子表面结合抗体检测附睾功能检测精子形态学评估标准在评估精子正常形态时应采用严格标准（Krugeretal.,1986;Menkveldetal.,1990;Coetzeeal.,1998)精子包括头、颈、中段、主段和末端。由于通过光学显微镜很难观察到精子末端，因此可以认为细胞是由头（和颈）和尾（中段和主段）组成。只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。所有处于临界状态的精子均认为是异常。WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较精子头部判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准精子头外形上应该光滑、规则，大体上呈椭圆形；长度95%可信限区间为3.7-4.7；宽度95%可信限区间为2.5-3.2；长度比95%可信限区间为1.3-1.8，顶体界限清晰，占头部的40%-70%；精子头的形状必须是椭圆形的，长度为4。0-5.0um；宽为2.5-3.5um；长宽比为1。50-1.75之间；顶体界限清晰，占头部的40%-70%异常标准有空泡的头（超过2个空泡或未染色的空泡区域占头部的20%以上）顶体后区有空泡、顶体过小或顶过大的头（小于头部的40%或大于头部的70%）有空泡的头（未染色的空泡区域占头部的20%以上）；顶体过小（小于头部的40%）WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较精子颈和中段判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准中段应细，规则，大约与头部长度相等，并且主轴与头部长轴一致；长度95%可信限区间为3.3-5.2宽度95%可信限区间为0.5-0.7中段应细，大约为头部长度的1.5倍，并且在轴线上紧贴头部；宽度1um异常标准缺陷包括：颈部急剧弯曲；中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段以及上述缺陷的任何组合。缺陷包括：颈部“弯曲”（颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%）中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段以及上述缺陷的任何组合。WHO第5版与第4版精子形态判断标准比较精子主段判断标准分类WHO第5版WHO第4版正常标准主段应是直的，均一的，比中段细，其长约45um。主段应是直的，均一的，比中段细，非卷曲的，其长约为45um。异常标准主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断裂主段急剧弯曲、主段宽度不规则、主段卷曲以及上述缺陷的任何组合主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断裂主段弯曲（90度）、主段宽度不规则、主段卷曲以及上述缺陷的任何组合精子胞浆小滴判断标准胞浆小滴体积大于精子头部的1/3胞浆小滴体积大于精子头部的1/3WHO第四版与第五版精子形态学评估标准比较研究研究目的：比较WHO第四版与第五版精子形态学评估标准的变化。研究对象：1000个精子图片，一张精子形态质控版研究方法：1.用WHO第四版的评估标准，对上述精子进行评估2.精子库9名工作人员学习第五版精子形态学评估标准及精子图谱，并进行室内质量控制，统一评估标准，工作人员之间无显著差异。3.用WHO第五版的评估标准，对上述精子再次进行评估。4.比较上述两种标准分析结果的差异。研究结果：WHO第五版与第四版相比1.形态正常精子百分率高，头部异常率低，尾部异常率低，有显著差异；2.颈和中段异常率、胞浆小滴率无显著差异。WHO第五版第四版精子形态学评估标准的主要区别1、头部外形轮廓判断变的宽松，仅要求大致成椭圆形。2、对头部空泡的判断更严格，多于2个空泡或者顶体后区空泡，都判断为异常。3、颈部的长度有原来头部的1.5倍缩短为1倍，并且宽度比第4版要更细。4、尾部只有尖锐的折角才判断为异常，而不再以弯曲角度90度为界限。5、胞浆小滴的标准无差异。精子形态学评估正常形态精子百分率与受精率相关异常形态精子的类型、部位和程度更重要WHO第五版手册中精液参考值的来源12个月内使女方妊娠的男性精液参数400-1900份精液标本（来自3大洲，8个国家）单侧参考范围，第5百分位数作为下限任何精液参数的高值都不能判断生育力-精浆ɑ-葡糖苷酶测定精浆总ɑ-葡糖甘酶的测定检测方法为葡萄糖氧化酶法精浆