组织学与胚胎学的研究方法

组织胚胎学--人体发育和功能组织学组胚教研室王海涛欢迎大家学习•组织学与胚胎学的早期研究和发展•现代组织学与胚胎学的研究和发展•我国组织学和胚胎学的研究和发展•组织学与胚胎学的研究方法内容提要组织学(histology)：研究机体微细结构及其相关功能的科学胚胎学(embryology)：研究个体发生发育及其有关机制的科学•基础：细胞学•研究方法：显微镜观察•研究水平：细胞、亚细胞•在发展历程中，二者的研究内容相互交叉和推进组织胚胎学(histo-embryology)：人体发育和功能组织学个体发生起始于受精卵。受精卵经分裂增殖和细胞分化，形成多种不同类型的细胞(cell)。机体的一种或几种细胞聚集形成一定构型的组织(tissue)。组织由细胞和细胞间质（细胞外基质）组成。组织有多种类型，每种具有一定的形态结构特征和相关的功能。基本组织有四种：上皮组织、结缔组织、肌组织和神经组织。几种组织相互结合，组成器官和系统一、组织学与胚胎学的早期研究和发展古代-15世纪解剖学组织学胚胎学的发展古代•中医书中即有解剖、脏腑的记载。•古希腊对胚胎学作出了重大贡献（Hippocrates和Aristotle）。•前2世纪，古罗马医生Galen著作中记录了胃肠、子宫等器官的分层结构，《关于胎儿的形成》描述了羊膜、尿囊和胎盘结构。中世纪（6-14世纪）•发展缓慢。•有些医书中可见解剖资料叙述。近代解剖学组织学胚胎学的发展16世纪•意大利daVinci绘制700多幅解剖图，大多数相当准确。•比利时医生Vesalius是现代解剖学的奠基者，1543年发表《人体的构造》。•英国Harvey发现血液循环，观察鸡胚和哺乳动物胚胎发生，发表《心血管运动论》《胚胎发生论》，强调“一切动物皆起源于卵”，认为胚胎由子宫分泌17世纪•显微镜发明，打开了新的观察领域。•细胞发现。•脾、肺、肾、皮肤等一些器官结构被揭示。•卵泡发现。•两栖类卵子人工受精实验，提出两性配子的结合是个体发生的前提•胚胎学流行“先成论”，认为胚胎是在生殖细胞中预先存在的，发育不过是继续长大。18世纪•德国人Wolff用显微镜直接观察胚的发育，认为卵中没有预先形成的物质，也没有组织和器官，否定“先成论”，主张胚胎是逐渐分化演变而成的－－“渐成论”。•清朝王清任1796年写成《医林改错》。•19世纪•法国人Bichat发现组织(tissue)，1801年发表《膜的研究》，将其分为21种。•德国人Mayer于1819年提出histology。•德国人VonBear提出贝尔定律。•德国Remark在Bear工作基础上，提出三胚层学说。•达尔文1859年发表《物种起源》。•德国人Schleiden和Schwann创立细胞学说。•奥地利人Mendel于1865年创立细胞遗传学说。•德国人Weismann于19世纪末提出机体细胞有生殖细胞和体细胞之说，认为生殖细胞含有决定胚胎细胞分化为不同组织的“决定子”。•丹麦人Jahanngen于1909年将遗传因子命名为“gene”•德国人Roux于1887年进行分割蛙卵分裂球试验，开创了实验胚胎学研究•His最早制作胚胎连续切片并进行三维重建，研究胚胎各系统和器官的发育•Golgi于1889年发明银染技术，发现神经细胞内的“内网器”（高尔基体）•Altman于1894年作活体细胞染色，在多种动物和植物细胞中看到线粒体•许多重要的细胞和组织结构在19世纪中、后期发现和命名•20世纪，是现代组织学和胚胎学蓬勃发展的时期，新技术和新仪器不断涌现并应用于细胞学、组织学、胚胎学的研究二、现代组织学与胚胎学研究和发展三、我国组织学与胚胎学研究和发展•开始于20世纪初•50年代起，我国组织学与胚胎学事业发展进入一个新的时期•近20多年是我国组织学与胚胎学事业蓬勃发展、快速进步的最佳时期四、组织学与胚胎学的研究方法•一般光学显微镜术•几种特殊显微镜的应用•组织化学和细胞化学术•免疫细胞化学术•原位杂交术•放射性核素示踪术•细胞和细胞化学定量术•电子显微镜术•组织培养术•细胞融合术•显微外科术1、一般光学显微镜术•切片制备•石蜡切片：最常用•冷冻切片：常用于酶组织化学染色•涂片、磨片、铺片、连续切片•染色碱性染料：含氨基、二甲氨基等碱性助色团的染料酸性染料：含有羧基、羟基、磺基等酸性助色团的染料嗜酸性、嗜碱性、中性最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE染色法2、几种特殊显微镜的应用•荧光显微镜：用来观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构•相差显微镜：用于观察组织培养中活细胞形态结构•暗视野显微镜：用于观察因反应或分辨力不足的微小颗粒，可分辨0.004-0.2微米的微粒，适用于观察细胞内线粒体运动及标本中细菌等微粒的运动•共聚焦激光扫描显微镜：可对细胞的多种功能进行全自动、高效、快速微量定性和定量研究等3、histochemistry和cytochemistry•糖类：显示多糖和蛋白多糖的常用方法是过碘酸希夫反应（PAS反应），原理多糖醛紫红色沉淀过碘酸氧化Schiff试剂PAS染色示肝糖元PAS染色•脂类：包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。常用苏丹染料、油红O，尼罗蓝等溶于脂类的染料染色•酶：目前有100多种酶组织化学染色法，基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反应产物与某种捕获剂发生反应，形成沉淀或有色的最终产物，借此检测该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱•核酸：显示DNA的传统方法是福尔根反应(Feulgenreaction)，切片先用稀盐酸处理，使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的联接键打开，形成醛基，再与希夫试剂作用。原理同PAS反应，使细胞核DNA显紫红色4、immunocytochemistry/immunohistochemistry是应用免疫学原理，通过抗原与抗体的特异性结合，显示组织内和细胞内的多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。。这种检测技术的特异性强、灵敏度高、应用广泛，是生物学和医学领域中的重要研究手段。通常需对已知抗原或抗体进行标记，用相应的显色和观察方法检测目的抗体或抗原。常用的标记物有荧光素、铁蛋白、辣根过氧化物酶等荧光素标记显示皮肤毛细血管内皮细胞免疫组织化学免疫荧光技术5、原位杂交技术(insituhybridization)是一种核酸分子杂交技术，通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。基本原理是用已知碱基序列并具有标记物的RNA或DNA片段即核酸探针（nucleicacidprobe），与组织切片或细胞内的待测核酸进行杂交，通过标记物的显示，在显微镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。用核酸杂交技术检测细胞内某一基因在染色体上的定位，称染色体原位杂交。用核酸杂交技术检测某一基因的转录物mRNA的细胞定位和转录状况，称细胞原位杂交核酸探针：主要有三种•利用大肠杆菌重组带有目的基因的质粒DNA，制成互补DNA探针（cDNA）•应用限制性核酸内切酶消化制成线性DNA模板，在体外转录获得反义RNA探针（cRNA）•依照待测核酸的核苷酸序列，应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针原位杂交示脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性6、电子显微镜术透射电镜术Transmissionelectronmicroscopy，TEM•是用电子束穿透标本，经过电磁场的会聚、放大后，在荧光屏上显像，或将影像投射到照相底片•由于电子束穿透力弱，故经过固定的电镜标本需制成超薄切片（50～80nm），并用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色扫描电镜术Scanningelectronmicroscopy，SEM•用于观察细胞、组织和器官表面的立体细微结构•需将小块组织经固定、脱水、干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜和金属膜•图像清晰，富有立体感电镜扫描图肺巨噬细胞吞噬大肠杆菌电镜扫描图电镜图（冷冻蚀刻）7、组织培养技术(tissueculture)是将离体细胞或组织放置在适当的环境条件下进行培养的一种技术方法，可用以检测各种理化因子、细胞因子等对细胞增殖、分化、代谢、运动、吞噬、分泌等生命活动和细胞行为的影响，还可用细胞培养技术研究细胞癌变、逆转的机制。子宫内膜上皮细胞体外培养的大鼠肝细胞8、细胞和细胞化学定量术•显微分光光度定量术：应用显微分光光度计测定组织化学和免疫组织化学染色标本的反应强弱，进行化学成分的定量分析•形态定量术：运用数学和统计学原理对组织和细胞进行二维和三维的形态测量研究。其中三维立体结构的研究又称体视学•流式细胞术：应用流式细胞仪对单个细胞生物化学和生物物理特性进行快速定量测定流式细胞术•应用流式细胞仪对单个细胞进行生物化学和生物物理特性的快速定量测定，可进行细胞周期各时相细胞的比例和细胞内DNA、RNA、蛋白质的含量分析，淋巴细胞亚群的分离和定量，血细胞增殖情况的分析，杂交细胞等的分选等。•其工作原理是分离被检细胞，制成悬液，并进行荧光染色或标记，然后使单细胞液流快速通过该仪器的激光照射分析区，被检细胞产生不同的荧光信号并转变为电脉冲，分别输入计算机内贮存，同时显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据。组织胚胎学的学习方法•建立立体与动态的概念•注意结构与功能的联系•重视理论与实践的结合•勤奋加技巧，学习效果好TheEnd