单克隆抗体生产为何要多次克隆专一抗体检验阳性细胞

课本中的图解谈到了在筛选培养基选择了杂交瘤细胞之后，专一抗体检验阳性细胞需进行多次克隆后检查，其机制和原理，教参与课本都没有解释清楚，经查询专业医药生产文章得知以下解释：筛选培养基得到的专一阳性克隆需再次克隆的原因：可以简单理解为：1.可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞2.刚融合的细胞不稳定一般再经三次克隆选择后，才能达到100%阳性克隆。细解做法为：第一次筛选培养（HAT）：去除无关细胞，得到杂交瘤细胞。将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，加入到96孔板内，根据情况2-3天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。7-14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞。能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。（有的死，有的活，活的有些可以用单一抗体检验阳性，但阳性孔可能由1~多个细胞克隆得到）第二次筛选：初筛阳性克隆可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，且刚融合的细胞不稳定，故应尽早进行克隆。克隆后的细胞集团生物学特性完全相同。（将其单个分开）融合后的杂交瘤细胞要经过三次克隆化才能达到100%的阳性克隆。常用方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法，把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板中，理论上每孔一个细胞，第一次克隆化时用HT培养液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培养液。也要加入饲养细胞。软琼脂法，在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体的，可用毛细管将小球吸出，团块经打碎后，移入96孔板继续培养。