HRM检测基因

CompanyLOGO基因检测流程基因检测流程样本准备核酸提取核酸定量样本检测结果分析石蜡组织块血液DNARNADNAFFPETissueKitDNeasyBlood&TissueKitRneasyFFPEKitRneasyTissuekitRNABloodMiniKit浓度测定浓度稀释配制体系上机运行LightCylcer®480软件逆转录Kit样本的准备样本的收集对于样本的收集和选择，主要是为了保证一定的DNA质量以便检测的顺利进行。石蜡样本需要保证样本存储时间不能太久，超过三年的样本质量无法保证；新鲜组织样本收集之后如不立刻使用，可以使用乙醇、甲醛试剂4℃冰箱保存。血液样本使用抗凝采血管取病人血样本2ml以上，上下慢慢混匀，4℃冰箱保存。（注意：切不可置于-20℃中，血细胞在融解的时候易发生溶血现象）石蜡样品的切取石蜡块固定至切片机上，调整切片机切片厚度设置为6-10μm或者用刀片手动切，首先切除表面的2-3片，以去除表面氧化层（使用刀片自己手切时，请注意不要切太厚，也要保证蜡块完整性），将切取的5-6片组织放入1.5mlEP管中待用。DNA的提取DNA的提取DNA的提取（QIAampDNAFFPETissueKit，货号56404）1)向有石蜡组织的1.5mLEP管中，加入1ml二甲苯涡旋振荡混匀，以充分溶解组织周围石蜡，20000g离心2min吸去上清去除石蜡，如果石蜡过多，可以用二甲苯再洗一次。2)加入无水乙醇1ml（去除二甲苯），20000g离心2min吸尽上清后开盖直至残余乙醇全部挥发（大约10min）。3)加入180μlBufferATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀。56℃1h（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分）。90℃1h（注意管盖，由于90°高温可能会导致开盖，以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间应该将样本置于室温中）。4)短暂离心使液体聚于管底，加入200μlBufferAL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀。5)短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000g离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。6)加入500μlBufferAW1，离心6000g，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。7)加入500μlBufferAW2，离心6000g，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。8)离心14000rpm，3min，以去除收集柱中的残余液体。9)开盖后放置5-10min，以去除残余乙醇。10)加入洗脱液20μl，然后室温静置5min。11)离心20000g，1min，收集洗脱液。RNA的提取RNA的提取RNA的提取（QIAGENRneasyFFPEKit,货号73504）(注：为了保护自己以及尽可能的避免样品被Rnase降解，在整个提取过程至逆转录完毕，全程戴手套和口罩)1）向有石蜡组织的1.5mLEP管中，加入1ml二甲苯涡旋振荡混匀，以充分溶解组织周围石蜡，14000rpm离心2min吸去上清去除石蜡，如果石蜡过多，可以用二甲苯再洗一次；2）加入无水乙醇1ml（去除二甲苯），20000g离心2min吸尽上清后开盖直至残余乙醇全部挥发（大约10min）。3）加入150ulBufferPKD,10ul蛋白酶K，重悬沉淀，涡旋混匀，短暂离心，将液体甩到管底；4）水浴55℃，15分钟;80℃,15分钟;5）加入320ulBufferRBC,充分混匀，转移至含2ml收集管的gDNA结合柱，20000g,离心30秒，弃柱留流出液；6）向流出液中加入720ul无水乙醇，反复吹打混匀，将700ul样品转移至含2ml收集管的RneasyMinElutespincolum，14000rpm,离心30秒，舍弃流出液，重复操作直至所有的样品过完柱子；7）向RNA结合柱中加入500ulBufferRPE,盖上管盖，20000g,离心15秒，洗膜，弃流出液；8）向RNA结合柱中加入500ulBufferRPE,盖上管盖，20000g,离心2分钟，洗膜，弃流出液；9)将RneasyMinElutespincolum放入一个新的干净的2ml的离心管中，敞开盖，20000g，离心5分钟，弃套管和甩出液（管盖顺着离心方向摆放，否则管盖易离掉）；10）将RNeasyMinElutespincolum放入干净的1.5ml收集管中，室温静置2分钟，直接将20ulRNase-free水加至膜上，盖上管盖，室温静置2分钟，20000g,离心1分钟(管子洗脱后再盖上盖子标记，管盖顺着离心方向摆放，否则管盖易离掉)，洗脱RNA。RNA的提取逆转录（Fermentas,货号K1622）1）1ul随机引物（RandomHexamerprimer），11ulRNA模板，加入样品管中，作好标记，将液体离心至管底，放入PCR仪，65℃，5分钟；2）多于2个样本，配制MIX,如3个，各试剂分别乘以3.2，然后8ul/管，加入各样品管。25℃,5分钟；42℃,60分钟；70℃，5分钟；4℃，5分钟。5xreactionbuffer4µL*3.2=12.8RNaseinhibitor(20u/ul)1µL*3.2=3.210mMdNTPMIX2µL*3.2=6.4M-MuLVReverseTranscriptase(200u/ul)1µL*3.2=3.2Totalvolumeperreaction8µL样品的定量与稀释样品DNA浓度的测定(核酸定量仪ND1000)样本质量条件如下：260/280比值应该1.6-1.8；260/230比值应该大于2.0。样品浓度的稀释样品要和对照的浓度保持一致。检测出样品浓度后，用洗脱液或去离子水对样品进行稀释，石蜡样本统一稀释浓度为30ng/ul（石蜡处理的样本DNA受损，因此低浓度可能会导致结果不准确），新鲜组织样本DNA统一稀释至10ng/ul。反应体系的配制1.所有试剂用前混匀，短暂离心,置于冰上；2.先根据反应数配制目的基因,除模板外的MIX，如检测1人份的EGFR基因21外显子的突变，MIX配制如下：一个反应是待测样本，另一个是校准品。3.将步骤2中的MIX18ul/份，依次加入RochePCR8连管或PCR板（如果反应数大于16时，可选择96孔板）。4.取稀释10倍后的样品DNA或cDNA2ul、标准品2ul依次加入各反应管中，混匀，再短暂离心。目的基因H2O7*2.2=15.42*ReationMIX10*2.2=22primer1*2.2=2.2total18ul打开LightCylcer®480,编辑反应程序：（1）预变性：95℃，5min;（2）扩增95℃,10sec;60℃,15sec;40cycle72℃,20sec.（3）溶解95℃，1min；40℃，1min；65℃，1sec；95℃，continous，每度采集10次信号。（4）保存程序，将反应管或板放入480反应模块，点击StartRun,开始运行。（5）编辑样本子集和定义相对定量各要素。（6）运行完毕以后，点击Analysis中AdvancedRelativeQuantification,选择相应子集，点击caculate,给出本次反应的结果。上机运行结果分析仪器及试剂仪器及试剂盒厂家/型号价格板式离心机Eppendorf/5804$11600移液器单支Eppendorf$205板式离心机湘仪/L550￥18000掌上离心机其林贝尔/LX-200￥460核酸蛋白微量定量检测仪DNAFFPETissueKitQIAGEN/56404(50次)￥2200DNeasyBlood&TissueKitQIAGEN/69504(50次)￥1630RneasyFFPEKitQIAGEN/73504(50次)￥4500RneasyTissueMinikitQIAGEN/74104(50次)￥3210RNABloodMiniKitQIAGEN/52304(50次)￥3900逆转录KitFermentas/K1622(100次)￥1200CompanyLOGO