酶制剂的生产

LOGO主要内容2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状2.2酶的发酵技术2.3酶的分离纯化2.4酶的剂型与保存LOGO2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状LOGO2.1.1．新技术在生产中的应用三种方法：组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶微生物发酵：最大量的来源化学及生物合成：生物重组高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥LOGO2.1.2.集中垄断，市场全球化：规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90%丹麦诺维信novozymes→1978年进入中国（天津）；美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡，2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）；LOGO2.1.3.品种、规模不断扩大目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。国际以液体、颗粒为主。国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。LOGO2.1.4.应用领域不断扩大：美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。LOGO2.2酶的发酵技术LOGO2.2酶的发酵技术利用微生物产酶的优点是：(1)微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2)微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3)微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4)可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。LOGO2.2.1产酶微生物菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。LOGO第二章酶的发酵生产酶源酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。LOGO产酶微生物的获得（1）从有关菌种保藏机构购买如中国科学院微生物研究所CGMCC，日本大阪发酵研究所IFOATCC(AmericanTypeCultureCollection)DSMZ(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)JCM(JapanCollectionofMicroorganisms)VKM(All-RussianCollectionofMicroorganisms)LOGO产酶微生物的获得CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures荷兰真菌中心收藏所)UKNCC(UnitedKingdomNationalCultureCollection)NCIMB(NationalCollectionsofIndustrial,foodandMarineBacteria)LOGO（2）从自然界中分离筛选从与产生目的酶菌种可能相适应的生态环境中，采样分离筛选。1克土壤中含有1×108个微生物，自然界蕴藏着巨大的微生物资源。同时重视微生物资源、基因文库、基因表达载体等方面的建设，以及极端环境微生物，不可分离微生物，绝对厌氧微生物等新的种质资源的研究开发。LOGO从极端环境微生物和不可培养微生物筛选新酶种嗜热微生物（Thermophiles60-85℃，超嗜热菌生长温度85℃以上,105℃）。嗜冷微生物（Psychrophiles-10～0℃）嗜盐微生物(Halophiles,含盐32%或5.2%)嗜酸微生物(Acidophiles,pH2.5)嗜碱微生物(Alkalophiles,pH11)嗜压微生物(Barophiles，1.01×105KPa,4×107KPa)LOGO不可培养微生物用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够从不可培养的微生物中分离到DNA，并用作克隆来源，可获得更多种类的酶。LOGO链霉菌（Streptomyces）链霉菌是一种放线菌。菌落呈放射状，有分枝菌丝体，菌丝直径0.2-1.2μm，G+。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生菌丝形成孢子链。可产生葡萄糖异构酶，纤维素酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，几丁质酶，青霉素酰化酶等。LOGO放线菌的形态放线菌的菌落LOGO霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusoryzae）青霉（Penicillium）木霉（Trichoderma）根霉（Rhizopus）毛霉（Mucor）红曲霉（Monascus）LOGO根霉的形态各种曲霉的菌落LOGO细菌大肠杆菌（Escherichiacoli）芽孢杆菌（Bacillus）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）蛋白酶地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）高温α-淀粉酶LOGO杆菌红弧菌杆菌红弧菌LOGO酵母菌啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）可产丙酮酸脱羧酶，醇脱氢酶等。LOGO酵母的形态红酵母的菌落LOGO产酶微生物的分离筛选方法（1）平板分离（选择性分离筛选平板）（2）摇瓶逐个检测方法培养基细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH7.0，30-37℃）霉菌：可用察氏、土豆（PDA）、麦汁琼脂培养基（pH5.5，25~20℃，为了防止霉菌菌落蔓延连成一片，可加入0.1%去氧胆酸钠、0.1%山梨糖等限制菌落扩散）放线菌：高氏培养基、甘油精氨酸培养基等，pH6.8~7.0LOGO酵母：用麦汁琼脂培养基（pH4.5~5.5）为了提高菌种分离效率，分离培养基中可添加一定数量的药剂以抑制干扰微生物的生长。如为了抑制霉菌的生长，可加入30~50U/ml制霉菌素、克念霉素、杀霉素等多烯类抗生素，不妨碍细菌的生长繁殖。为了抑制细菌的生长，可添加青霉素（30U/ml）、四环素、猛加拉红（0.001%），不干扰霉菌的生长。为了抑制酵母的生长，可添加放线菌酮（50mg/ml），不影响细菌的生长。选择性培养基LOGO选择性培养基用酸性或碱性培养基，可分离耐酸、耐碱微生物；用添加了高浓度食盐培养基，可分离耐盐微生物；用添加了高浓度盐或蔗糖的培养基，可分离耐高渗透压的微生物；在高温下培养，可筛选耐热、耐高温微生物，分离芽孢杆菌，可先将样品于80℃加热10-15min，可杀死不产芽孢微生物后，再进行分离。LOGO为了提高工作效率，可设计一些肉眼可检测的方法，如水解透明圈、变色圈等方法，鉴别出产酶菌落。LOGO酶培养基中的底物检测方法α-淀粉酶0.1%~0.5%可溶性淀粉平板浇注稀碘液，可在兰色背景显示出明亮的水解圈蛋白酶干酪素透明圈果胶酶果胶平板浇注1%溴化十六烷基三甲铵，未水解的果胶沉淀而形成白色背景产生果胶酶的菌落周围出现透明的水解圈乳糖酶向长菌落的平板培养基上喷洒邻硝基苯β-D-半乳糖（ONPG），由于乳糖酶可分解ONPG而游离出黄色邻硝基苯，检出产酶菌。普鲁兰酶0.3%普鲁兰糖培养后浇注乙醇，产酶菌株可产生水解圈纤维素酶0.5%磷酸膨化纤维产酶菌落周围形成水解圈LOGO免疫学检测方法酶联免疫荧光测定技术，96孔LOGO2.2.2酶的发酵技术2.2.2.1培养基培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。LOGO（1）碳源碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都只利用有机碳的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中12～16碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。LOGO不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。LOGO（2）氮源氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。LOGO不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3%的无机氮源。LOGO（3）碳氮比在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)生产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75%、玉米粉0.625%、鱼粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆饼石灰水解液10%组成的培养基；LOGO淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高，例如枯草杆菌TUD127α－淀粉酶生产采用由豆饼粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%组成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生产培养基碳氮比的一般规律，但是由于菌种很多而其性质各异。很难说都是符合上述规律的。LOGO（4）无机盐微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定pH范围可以扩大到5～7。LOGO（4）无机盐钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进酶生产。在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100ppmCo2+和Zn2+，放线菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。LOGO（5）生长因子微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素32~128mg/mL。LOGO（6）产酶促进剂产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：一是诱导物，二是表面活性剂。表面活性剂，如吐温－80的浓