第六章微生物生长

第六章微生物的生长Chapter6microbialgrowthYelimin2019年10月13日星期日9时4分50秒生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加生长growth指生物个体数目的增加繁殖repro-duction在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程2019年10月13日星期日9时4分50秒本章目录第一节微生物纯培养的生长第二节理化因素对微生物生长的影响第三节微生物生长的控制2019年10月13日星期日9时4分50秒平板划线法稀释倒平皿法单细胞挑取法选择培养基分离法第一节微生物纯培养的生长一纯培养的分离方法2019年10月13日星期日9时4分50秒1.平板划线法2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒2.稀释倒平皿法2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用极细的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。3.单细胞分离法2019年10月13日星期日9时4分50秒各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。4.选择培养基分离法2019年10月13日星期日9时4分50秒微生物纯培养分离方法的比较分离方法应用范围平板划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究选择培养基分离法适用于分离某些生理类型较特殊2019年10月13日星期日9时4分50秒平板菌落计数法直接计数法薄膜过滤计数法比浊法称重法生理指标法二微生物的群体生长（一）微生物群体生长测量方法2019年10月13日星期日9时4分50秒这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数1直接计数法2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数２．平板菌落计数法2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒３．薄膜过滤计数法常用微孔薄膜过滤法测定空气和水中的微生物数量。2019年10月13日星期日9时4分50秒此法适用于测定量大、含菌浓度很低的流体样品，如水、空气等。2019年10月13日星期日9时4分50秒4．比浊法为测定菌悬液中细胞数的快速方法。原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比，可用分光光度计测定光密度，对照标准曲线求出菌液浓度。此法适用于菌液浓度在107个/ml以上、无杂物、颜色较浅的样品。2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。5.称重法2019年10月13日星期日9时4分50秒蛋白质总量蛋白质总量＝含氮量×6.25细胞总量＝蛋白质总量÷(50%～80%(或65%))≈蛋白质总量×1.54DNA含量核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4×10-5ng.细菌细胞的干重约为湿重的20~25%。2019年10月13日星期日9时4分50秒样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。6.生理指标测定法2019年10月13日星期日9时4分50秒在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线growthcurve（二）细菌群体生长规律2019年10月13日星期日9时4分50秒生长曲线可分：延滞期lagphase对数期logphase衰亡期declinephase稳定期stationaryphase2019年10月13日星期日9时4分50秒将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、调整期。延迟期的特点：分裂迟缓、代谢活跃、细胞体积增长快、细胞质均匀、细胞中蛋白质和RNA含量高，对不良环境抵抗力降低，容易产生各种诱导酶等。1.延滞期lagphase2019年10月13日星期日9时4分50秒在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”（接种菌）；③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。2019年10月13日星期日9时4分50秒对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。2.对数期logphase2019年10月13日星期日9时4分50秒对数期生长特点细胞代谢活性最强，酶活力高而稳定，组成新细胞物质最快，生长速率最大，代时最短，对环境变化敏感。2019年10月13日星期日9时4分50秒代时的计算以二分裂的细菌为代表，假设细菌培养体在对数期to时的总菌数为No，那么到ｔ时的菌数Nt＝No×2n；式中ｎ为to到ｔ这段时间内细菌的繁殖代数。如果用G来表示世代时间(或倍增时间):即群体细胞数量增加一倍需要的时间，则：G＝(t-to)/n(1)Nt＝No×2nlgNt＝ｎlg2＋lgNoｎ＝〔lgNt－lgNo〕/lg2=lgNt/N0/0.301(2)将(2)代入(1)G＝0.301(t-t0)/lgNt/N0(3)通过实验可测得No、Nt和时间ｔo、ｔ，由(3)式可计算出供试微生物的世代时间G2019年10月13日星期日9时4分50秒温度（℃）代时（min）温度（℃）代时（min）101520253086012090402935404547.52217.52077大肠杆菌在不同温度下的代时2019年10月13日星期日9时4分50秒原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜特点:生长速率常数R等于0菌体产量达到了最高点菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系，3.稳定期stationaryphase2019年10月13日星期日9时4分50秒获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等2019年10月13日星期日9时4分50秒稳定期的细胞行为δ细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物δ多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢δ有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物δ是乳酸等发酵生产的最佳收获期2019年10月13日星期日9时4分50秒现象：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。特点：细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶（autolysis）有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期4.衰亡期declinephase2019年10月13日星期日9时4分50秒连续培养(continuousculture)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(Batchculture)。最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入，培养物流出)的控制系统三、连续培养continuousculture2019年10月13日星期日9时4分50秒恒浊器（turbidostat）连续培养的两种方法：恒浊器和恒化器恒浊器:控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器可达到恒密度的目的使微生物在最高生长速率下生长为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器2019年10月13日星期日9时4分50秒恒化器（chemostat）一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子，控制生长速率可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体2019年10月13日星期日9时4分50秒2019年10月13日星期日9时4分50秒恒化器2019年10月13日星期日9时4分50秒恒化器与恒浊器的比较2019年10月13日星期日9时4分50秒优点：缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低劳动力消耗及体力劳动强度；有利于研究生长速率对细胞形态、组成和代谢活动的影响；缺点：杂菌污染和菌种退化、营养物质利用率低连续培养与分批培养的比较2019年10月13日星期日9时4分50秒影响因素：物理因素：温度辐射氧氧化还原电位水分化学因素：PH值重金属及其化合物卤素及其化合物有机化合物染料第二节理化因素对微生物生长的影响2019年10月13日星期日9时4分50秒一、温度生长温度的三基点最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度2019年10月13日星期日9时4分50秒微生物类型生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上2019年10月13日星期日9时4分50秒微生物生长温度范围(℃）最低最适最高枯草芽孢杆菌破伤风梭菌白喉棒状杆菌大肠杆菌肺炎克氏杆菌干酪乳细菌嗜热乳杆菌结核分枝杆菌金黄色葡萄球菌嗜热放线菌嗜热链霉菌黑曲霉酵母菌151415101210303015282070.530～3737～3834～3630～37373050～6337375040～4530～3925～30555040434040654255655347402019年10月13日星期日9时4分50秒二、辐射（1）紫外线(UV)波长范围是136～397nm最强作用