4第二章酶的生产

第二章酶的生产孙利芹海洋学院孙利芹2011制作提纲§2.1概述§2.2酶的合成模式与代谢调控§2.3液体法酶的生产§2.4固体法酶的生产孙利芹2011制作◈酶的生产方法※提出法：直接从动植物或微生物内利用化学等手段提取酶。如胰蛋白酶直接从胰脏中提取，木瓜蛋白酶直接从木瓜中提取。※发酵法：经过预选设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵法生产。§2.1概述孙利芹2011制作（1）酶的产量高；（2）易于培养和管理；（3）产酶性能稳定；（4）利于酶产品的分离纯化；（5)安全可靠◈发酵常用的微生物:(1)枯草芽孢杆菌—用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等；(2)E.coli-用于生产谷氨酸脱羧酶、Asp酶、β-半乳糖苷酶等(3)黑曲霉-用于生产糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶等(4)米曲霉-生产糖化酶、蛋白酶等。◈优良产酶细胞应具备的条件：孙利芹2011制作※微生物生长繁殖速度快，整个酶的生产周期可以缩短，酶产量可以无限的扩大。※微生物的种类繁多，同一种微生物在不同的条件下，其生长代谢的机制也不相同，那么涉及到的各种酶也就不相同，这就为各种各样的酶的生产提供了基础。例如：同样是微生物发酵生产Lys，在大肠杆菌中Lys的合成途径与谷氨酸棒杆菌Lys的生物合成途径有很大的差异，所以可以利用不同的微生物分别生产不同的酶。◈微生物发酵生产占主导地位的原因：孙利芹2011制作◈微生物发酵生产酶的生产方法☞按照微生物培养基形态1.固体法酶的生产：将微生物菌种接种在固体培养基上（以麸皮、米糠等为主要原料），在微生物生长的过程中，可以根据其生长的状态，间歇式的通风、喷水，以保证微生物在生长过程中对氧的需求，对温度的控制。优点：（1）设备投资少，易于上马，适合于中小型企业。（2）生产管理要求不高，对于培养过程中的无菌程度要求也不高，这就相应的降低了生产成本。（3）单位产品的酶活力较高。缺点：（1）无菌程度较低，生产的酶制剂大部分是水解酶类，而且往往只适合于混合物的水解。（2）发酵周期较长，通常需要4-5天。（3）生产过程中工人的劳动强度较大。孙利芹2011制作2.液体法酶的生产：又称为，液体深层培养,采用液体培养基至于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。是现代意义上的酶制剂生产方法。优点：（1）微生物生长在液体培养基中，有着良好的控温、传质的条件，生长速度较快，生产效率高，自动化程度高。（2）无菌程度较高，发酵液中的酶的种类比较单一，有利于酶制剂的分离提出。缺点：（1）由于生产过程中的无菌程度较高，生产成本增加。（2）产品往往需要分离、浓缩的等后处理，增加了设备投资和生产成本。如果生产粉剂型的生产成本更高，如果生产液剂型的，则产品的保质期较短，且需要添加防腐剂。孙利芹2011制作☞按照微生物的培养方式1.微生物的纯培养：指单一的微生物菌种的培养，包括固体和液体培养。2.混合培养：多菌种的混合培养，大多数情况下是利用空气或者原料本身所含有的微生物菌群接种培养，利用培养过程中的温度的调整来选择或者说淘汰某些微生物。通常采用固体培养。混合培养方法目前在我国的白酒生产领域仍然广泛的使用，其产品又称之为：大曲、药曲等，有着浓厚的地方特点。这种生产方法的主要缺点是，生产效率较低，酶制剂中以水解酶类为主，而且水解酶类的种类比较复杂，适合于混合原料的水解工艺；从工业化的角度讲，产品有着浓厚的地方特点，难以标准化。酶的液体深层培养生产方法，是建立在现代发酵工业的理论与实践的基础上的.两种方法的发酵，酶的生物合成机制，酶发酵的基本理论是相同的孙利芹2011制作§2.2酶的合成模式与代谢调控◈酶生物合成的调节机制★原核生物细胞中酶生物合成的调节★真核生物细胞中酶生物合成的调节◈酶生物合成的模式◈提高酶产量的方法孙利芹2011制作细胞合成的酶按其在细胞中量的变化，可分为：♫组成型（constitutive）:酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的影响不大，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶。♫适应型（adaptive）:酶在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响，又称调节型的酶，如E.coli的β-半乳糖苷酶(几个分子到几千个分子的差别)适应性酶的生物合成控制方式：转录水平调节；转录产物的加工调节；翻译水平的调节；翻译产物的加工调节；酶降解的调节等。◈酶生物合成的调节机制孙利芹2011制作一、原核生物细胞中酶生物合成的调节♥操纵子学说的提出——Jacob和Monod于1960年提出，阐明原核生物基因调节理论根据基因调节理论，原核生物DNA分子中，与酶生物合成有密切关系的基因有4种，分别是：R-调节基因（Regulatorgene）:调节基因可以产生一种阻遏蛋白.阻遏蛋白：是一个由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合能力。孙利芹2011制作S-结构基因（Structuralgene）:与多肽链有各自的对应关系，其上的遗传信息可以转录成mRNA上的遗传密码，在经翻译成酶蛋白的多肽链。O-操纵基因（Operatorgene）:可以与调节基因产生的阻遏蛋白中的一种结构结合,从而操纵酶生物合成的时机和合成速度.P-启动基因（Promotergene）:决定酶的合成能否开始P上有两个位点组成:一个是RNA聚合酶的位点,另一个是环腺苷酸(cAMP)与环腺苷酸受体蛋白(CRP)组成的复合物的位点。孙利芹2011制作操纵子（Operon）：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。原核生物中操纵子有两种类型：诱导型操纵子；阻遏型操纵子PROS1S2S3…………♥诱导型操纵子（Inducibleoperon）在无诱导物情况下，其基因的表达水平很低或不表达，只有在诱导物存在的条件下才能转录生成mRNA,进而合成酶,如乳糖操纵子.♥阻遏型操纵子（Repressibleoperon）在无阻遏物存在的情况下基因正常表达,当有阻遏物时,转录受到阻遏,如色氨酸操纵子.此外,启动基因通过cAMP-CAP复合物的结合与否,对酶的生物合成起调节作用转录水平的调节有3种模式:分解代谢物阻遏作用;酶合成的诱导作用;酶合成的反馈阻遏作用孙利芹2011制作分解代谢物阻遏作用葡萄糖效应：1942年Monod发现将大肠杆菌培养在含葡萄糖的培养基上时，葡萄糖被优先利用，同时葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的诱导合成。分解代谢物阻遏：细胞具有一优先利用的底物（通常是，但不总是葡萄糖）时，很多其它分解反应途径受到阻遏。分解代谢物阻遏的实质？分解代谢物阻遏是怎样在分子水平上起调节作用的？或CAMP是怎样控制酶水平的？细胞内缺少了环腺苷酸CAMP孙利芹2011制作调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA+细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)`过去称葡萄糖效应-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。孙利芹2011制作以cAMP在乳糖操纵子转录中的作用为例转录开始时：1.cAMP与CAP结合成cAMP-CAP复合物；2.cAMP-CAP复合物与乳糖操纵子启动基因上的CAP位点结合，从而活化了RNA聚合酶位点，促进聚合酶和RNA聚合酶位点的结合；3.RNA聚合酶进入RNA聚合酶位点，并向前漂移；4.RNA聚合酶进入操纵基因O位点内,转录开始.E.coli内,cAMP的胞内水平受三种不同过程的决定:1.CAMP是通过腺苷酸环化酶从ATP合成的;2.CAMP可为磷酸二酯酶降解;3.CAMP可通过细胞膜分泌到外部介质中腺苷酸环化酶ATPADPAMPCAMPAMP+CAMP磷酸二酯酶葡萄糖是如何调节CAMP水平的?X腺苷酸环化酶激活抑制磷酸二酯酶葡萄糖♪葡萄糖分解过程中的某种中间产物抑制了细胞内CAMP的形成♪可能是中间产物激活了CAMP的分解孙利芹2011制作catabolitegeneactivationprotein(CAP)regulatepositivelytranscriptionoflacoperongenesCAPsite-35-1015’3’RNApolymerase-35-10CAPcAMPCAPcAMPCAP+atglucosepresents孙利芹2011制作受到降解物阻遏的酶类还包括半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等的操纵子。受一种调节蛋白控制的几个操纵子构成的调节系统称为调节子。CAP与cAMP构成的复合物对各种不同糖分解代谢的调节即属于一种调节子。孙利芹2011制作加进某些物质,使酶的生物合成开始或加速进行的现象称为酶生物合成的诱导,简称诱导作用诱导物(inducer):能够引起诱导作用的物质,一般为酶催化作用的底物或其底物类似物或产物。例如：β-半乳糖苷酶的的作用底物乳糖及其类似物异丙基-β-D硫代半乳糖苷是其诱导物；半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，可作为诱导物诱导果胶酶的产生；纤维二糖作为纤维素酶的催化产物可诱导纤维素酶的生物合成以乳糖操纵子为例说明酶生物合成的诱导机制酶生物合成的诱导作用乳糖操纵子模型调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白无诱导存在阻遏蛋白阻挡操纵基因，结构基因不表达。调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白诱导物mRNA酶蛋白诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白不能阻挡操纵基因，结构基因表达。无诱导物存在时，R产生的阻遏蛋白与O的结合能力强，使得已在P上的RNA聚合酶无法经过O进入S的位置，遗传信息无法转录，酶不能合成当有诱导物存在时，诱导物与阻遏蛋白的结合使阻遏蛋白的结构发生变化，使之与O的结合能力弱，RNA聚合酶经过O进入S的位置，遗传信息转录，酶合成repressorregulatenegativelytranscriptionoflacoperongeneszyaiopzyaioprepressor(4polymer)RNApolymerasemRNA+galactosecorrespondbetweennegativeregulationofrepressorandpositiveregulationofCAPingenetranscriptioncontroloflacoperonCAPsite05’3’-35-10RNApolymeraseinhibitorgeneglucoseconcentrationislowerandlactoseconcentrationishighercAMPatglucoseabsentsCAPcAMPCAP+CAPcAMPRepressor(4polymer)+galactose孙利芹2011制作CAPsite05’3’-35-10RNApolymeraseinhibitorgenecAMPatglucosepresentsCAPcAMPCAP+glucoseconcentrationishigherandlactoseconcentrationislowerRepressor(4polymer)孙利芹2011制作反馈阻遏又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象共阻遏物（Corepressor）:引起阻遏作用的物质例如：无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物，它的过量存在，却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；Trp（色氨酸）作为色氨酸合成途径的终产物，过量积累会对其途径中的4种酶的生物合成起反馈阻遏作用。以色氨酸操纵子为例，说明反馈阻遏作用的调节机制：操纵基因的调节衰减子的调节酶生物合成的反馈阻遏作用色氨酸操纵模式—操纵基因的调节调节基因结构基因操纵基因mRNA酶蛋白无共阻遏物存在阻遏蛋白不能与操纵基因结合，