第二章---微生物发酵产酶

第二章微生物发酵产酶重点：微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其控制，提高酶产率的措施，固定化微生物发酵产酶。微生物发酵产酶是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理等方面的内容。在一定的条件下，酶可以催化各种生化反应，并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域广泛应用。微生物发酵产酶的工艺流程产酶菌种的筛选含菌样品的采集,菌种分离,产酶性能测定及复筛等全过程。一个优良的产酶菌种应具备以下几点：a繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期b容易培养和管理c产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭d产生的酶容易分离纯化e安全可靠、无毒性微生物酶的类型1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶，也指释放入培养基的酶。大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的。2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在内质网的核糖体上。酶的发酵生产方式①固体培养发酵:把菌种接入固体培养基中,保温数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测定酶活力,这种方法主要适用于霉菌.适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。②液体深层发酵:采用液体培养基,置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所需的酶.适合于大规模工业化生产。液体深层发酵优点①液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件②在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制③液体输送方便，易于机械化操作④占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制⑤产品易于提取和精制等③固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵前者是20世纪70年代后期，在固定化酶的基础上发展起来的发酵技术。是固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。后者是20世纪80年代中期发展起来的技术。是固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。固定化酶的优缺点优点多次使用可以连续反应纯化简单提高产物质量应用范围广固定化原生质体的优点属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间第一节酶生物合成的基本理论提取分离法微生物细胞发酵产酶酶的生产方法生物合成法植物细胞发酵产酶化学合成法动物细胞发酵产酶一、酶的生物合成遗传信息传递的中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA（一）RNA的生物合成--转录(transcription)定义以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。转录模板启动子（promotor)终止子(terminator)模板链（templatestrand）反意义链(antisensestrand)编码链(codingstrand)有意义链(sensestrand)DNA5´5´3´3´反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACRNA聚合酶有意义链反意义链RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’RNA的转录过程(三步)1.起始2.延长3.终止原核生物的RNA聚合酶(DDRP)E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2）αββ'α核心酶（coreenzyme）σ全酶（holoenzyme）αββ'ασ起始因子RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子（promotor)终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链有义链模板链（反义链）延长部位启动子：在DNA分子上，RNA聚合酶识别和结合的核苷酸序列，即转录作用起始的部位。终止子：DNA上的一段核苷酸序列，给RNA聚合酶提供终止转录的信号，也称终止序列。操纵子：转录的功能单位。（调控系统和结构基因的综合）。原核生物的基因组成（1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有ATG的起始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。（2）启动区：RNApol识别、结合和开始转录的一段DNA核苷酸序列。5′TTGACATATAATA/G3′3′AACTGTATATTAT/C5′-35序列-10序列识别序列Pribnow框转录起点16～19bp5～9bp（3）SD区：在起始密码子ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤的保守序列，其与16SrRNA3′端序列互补。结构基因的组成100bp启动子区SD区转录区转录中止区ATGORFTAA、TGA、TAGSD序列：5′AGGAGGU3′3′UCCUCCA5′16SrRNA（4）转录终止子和终止因子转录终止子：一个基因或一个操纵子3′端，提供转录停止信号的DNA核苷酸序列。终止因子：协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。A.-independent真核生物基因组成（1）基因区：（2）转录启动区：mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa3′5′NmRNAproteinP1P3P2DNA（3）转录终止子：对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚少。但在高等真核生物的细胞中，mRNA在靠近3′端区有一段非常保守的序列AAUAAA，这一序列为链的切断和poly(A)化提供了某些终止信号。定义以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码与反密码的碱基配对AUGACA5’蛋苏UGUGUU3’受位(A位)给位(P位)大亚基小亚基原核生物真核生物核蛋白体小亚基大亚基核蛋白体小亚基大亚基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白质rpS21种rpL36种rpS33种rpL49种不同细胞核糖体的组成核蛋白体的组成小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、一个中央凸出部和一个脊；二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形成一个隧道，在蛋白质合成中mRNA很可能从这里通过。大肠杆菌核糖体三维结构模型蛋白质的合成过程（大肠杆菌）氨基酸的活化肽链合成的起始肽链的延伸肽链合成的终止与释放氨基酸的活化与转运反应式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。在核糖体上合成多肽（三阶段）1、起始阶段2、延伸阶段3、终止阶段肽链合成的起始阶段1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：30S-mRNA-IF3fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。3.大小亚基结合IF130S起始复合物AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亚基mRNA蛋氨酰tRNAGTP大亚基GDP+Pi受位给位蛋蛋肽链合成的起始阶段肽链合成的延伸阶段1.进位:氨基酰-tRNA进入受位;2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。AUGACA5’3’UAC蛋苏UGUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’UAC蛋苏UGUGUUAUGACA5’蛋苏UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始复合体进位转肽移位Mg+K+肽链合成的终止阶段1.出现终止密码并与终止因子结合;2.肽键水解,多肽释放;3.tRNA,mRNA,大小亚基解离.AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’终终AUGUAA5’UAC3’终5’3’UAC终肽链二、酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。操纵子——基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质,structuralgene,S）控制部位操纵基因（operatorgene,O）启动子（promotorgene,P）（一）基因调控理论JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）调节基因(regulatorgene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)，通过与效应物(effector)（包括诱导物或辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。基因操纵子调节系统示意图调节基因启动基因操纵基因结构基因DNA转录（-）RNA聚合酶（+）转录翻译mRNA翻译阻遏蛋白蛋白质诱导剂控制区信息区操纵子RPOSDNACRP-cAMP复合物CRP+cAMPcAMP-CRP复合物的作用示意图启动基因（promotorgene）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。操纵基因（Operatergene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。(二)酶合成调节的类型1.诱导(induction)组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。2.阻遏(repression)分解代谢物阻遏(cataboliterepression)反馈阻遏(feedbackrepression)（三）酶合成的调节机制1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导乳糖阻遏蛋白（有活性）2.末端产物阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基