细胞增殖实验

细胞增殖检测方法细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。目前细胞增殖检测主要分为五类：DNA合成检测、代谢活性检测、细胞数量检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP浓度检测。在这些方法中作何选择，主要取决于所研究的细胞类型和研究方案。1.DNA合成检测这是目前实验室中检测细胞增殖最准确可靠的方式。该法是将放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。该方法耗时长，而且有个明显的弊端就，即使用和处理放射性物质既麻烦又不安全。不过，可以使用5-溴-2-脱氧尿苷BrdU来进行类似实验，因为BrdU也同样可以掺入到新合成的DNA中。但这样就需要进行额外的实验步骤，先孵育特异性BrdU单抗和带标记的二抗，然后再进行比色法、化学发光检测或荧光信号检测等步骤。该方法的优点就是不再需要放射性物质。BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。2.代谢活性检测检测细胞群体的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或AlamarBlue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。可以通过低配置或高配置的分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1。MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。因此，MTT主要作为终点检测方法。其他三种盐与AlamarBlue一样，都是可溶且无毒。它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。其中XTT的效率较低，需要添加额外的因子；WST1更灵敏有效，与其他盐相比能够更快显色；AlamarBlue的灵敏度也很高，只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。四唑盐和AlamarBlue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究，非常方便。它们适用的检测仪器包括：标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。3.活细胞数量最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。但细胞直接计数法操作繁琐费时，所需细胞量较多，不推荐使用。4.增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期（增殖期）表达，而在G0期和G1期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括：增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB，以及磷酸化组蛋白H3等。5.ATP检测细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。选择策略怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的，四唑盐—MTT法不够精确；最直接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确，但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐费时；而3H掺入法麻烦且不安全。所以，建议最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。EdU实验流程一、实验原理EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。二、材料及准备工作试剂、耗材名称品牌货号Cell-Light™EdUApollo®567InVitroImagingKit(500T)广州锐博C10327-1细胞培养板或培养皿☆试剂盒需4˚C储存，荧光试剂请避光，勿冻存，可稳定储存一年溶液配制1.PBS(pH7.2~7.6)PBS缓冲液10xNaCl80gKCl2gNa2HPO4·12H2O36.151g(OrNa2HPO414.4gK2HPO42.4g蒸馏水至1000mL调pH值至7.42.渗透剂(含0.5%TritonX-100的PBS)3.甘氨酸溶液(2mg/mL)（去离子水配配制，现用现配）4.细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)多聚甲醛4g1xPBS定容至100ml，磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下。如仍不溶，滴加NaOH(1N或0.1N），调PH值至7.4。5.1%BSA的PBS6.甲醇7.无水乙醇三、操作步骤及注意事项A流式检测1.样本制备1.1取对数生长期的细胞，105细胞接种于6孔板或培养皿中，培养箱中培养过夜；1.2可以根据实验需要进行各种药物处理。2.EdU标记2.1用细胞培养液以1:1000的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50µMEdU培养基；2.2每孔加入500µL50µMEdU培养基孵育2h。（☆此步务必在超净台内完成）3.细胞固定3.1用0.25％胰酶进行消化，转至离心管，用1×PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；3.2用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；3.34%多聚甲醛的PBS固定15min，1000rpm×5min，弃上清；3.4用含1%BSA的PBS吸打后，1000rpm×5min，弃上清；3.5300µLPBS吹散细胞，加入700µL无水乙醇(制成70%乙醇PBS液)，边加边震荡混匀，4℃固定24h以上；3.61000rpm×5min，弃上清。4．EdU反应4.1按下列顺序配置适量1×Apollo®反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：4.2加入500µL的1×Apollo®染色反应液，重悬细胞，避光室温孵育30min，1000rpm×5min；4.3加入500µL0.5%TritonX-100的PBS吸打，1000rpm×5min，重复2次；4.4每孔每次加入100µL甲醇冲洗1次，每次5min；PBS100µL脱色摇床5min。5.染色5.1用去离子水按100:1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；5.2弃上清，加入500µL1×Hoechst33342反应液，避光室温孵育30min，1000rpm×5min；5.3加入500µLPBS吸打，1000rpm×5min，重复2次，洗脱Hoechst33342反应液。6．流式分析6.11000rpm×5min收集细胞，300µLPBS吹散细胞，自备300目尼龙滤膜过滤（若吹打成单细胞悬液，可不过网）；转至流式管进行流式细胞仪分析，荧光通道依据实验仪器而设定。B荧光显微镜检测1.样本制备1.1取对数生长期的细胞，4×103~1×105细胞接种于96孔板中（☆细胞接种密度，没有严格要求，只要不影响显微镜下观察即可），培养箱中培养过夜；1.2可以根据实验需要进行各种药物处理。2.EdU标记细胞2.1用细胞培养液以1:1000的比例稀释EdU溶液（试剂A），制备适量50µMEdU培养基；2.2每孔加入100µL50µMEdU培养基孵育2h。（☆此步务必在超净台内完成）;2.3弃培养液，100µLPBS清洗细胞2次，脱色摇床上，每次5min。3.细胞固定化3.1每孔加入100µL4%多聚甲醛的PBS，室温脱色摇床孵育30min；3.22mg/mL甘氨酸脱色摇床孵育5min；（☆可在多聚甲醛固定时配置，现用现配。目的：中和多聚甲醛）3.3每孔加入100µLPBS脱色摇床孵育每次5min；3.4每孔加入100µL0.5%TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10min；3.5每孔加入100µLPBS脱色摇床孵育1次，10min。4．EdU反应4.1按下列顺序配置适量1×Apollo®反应液（☆现用现配，30分钟用完，以免破坏正常的反应体系）：4.2每孔加入100µL的1×Apollo®染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育30min；4.3每孔每次加入100µL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS）脱色摇床孵育2次，每次10min；4.4每孔每次加入100µL甲醇冲洗1次，每次5min；PBS100µL脱色摇床5min。5.染色5.1用去离子水按100：1稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；5.2每孔加入100µL1×Hoechst33342反应液，避光，室温脱色摇床孵育30min；5.3每孔每次加入100µLPBS脱色摇床孵育2次，每次5min，洗脱Hoechst33342反应液。6．图像获取及分析6.1建议染色完成后，立即进行观测，因易淬灭，曝光时间建议＜30ms；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不要超过3天。☆特别注意1、Apollo染色反应液一定要现用现配，按顺序加样，小心称量试剂E，注意避光。试剂E易氧化，用毕请立即盖紧瓶盖。若发现试剂E粉末变黄，极可能是发生了氧化失效。2、EdU的使用浓度，用50µM的较多，可以在10-50µM间选择合适条件。3、EdU荧光极易淬灭，请染色后立即送检或镜下观察。附：EdU与BrdU实验步骤比较EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速统计处于S期的细胞百分数来检测细胞DNA复制活性。适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。1.EdU的荧光染料是小分子物质(0.6×103)，相对于BrdU抗体这样的大分子物质(150×103)来说能够轻松地透过膜结构，这种能够有效快速地扩散和穿透组织的能力使得大的组织和器官碎片标本的快速处理成为可能。2.这种小分子化学反应检测方法反应快，效率高，反应时间仅需几分钟，相比BrdU检测需要抗原抗体过夜孵育，EdU检测只需要2.5个小时。3.EdU在检测掺入DNA分子中的乙炔基与小分子荧光叠氮化合物反应时不需要进行DNA变性处理（酸解、热解、酶解等），有效保证了DNA双链结构的完整性,避免样品损伤。不会像BrdU标记检测那样影响细胞核的复染，也不会破坏细胞的形态学特征以及细胞核抗原的识别位点。因此，EdU检测技术就可以与包括细胞周期分析在内的其他DNA染色相结合，并且很好地相容。这种简单化的处理方式同样有助于在组织器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，使其具有更高的敏感度和更快的检测速度。4.EdU标记可以通过结合其他抗体标记等技术，对细胞表面或细胞内特异性标志物进行多重检测和多参数分析，在细胞水平进行系统性定量检测，直接获取细胞多维信息，深入开展