CRISPR英雄谱

TheHeroesofCRISPR主讲人：王敏组号：第五组组员：黄勇、祝菁、张喆、杨爱玲、万娟、陈志毅、陶娅迪主讲内容1.文献解读2.CRISPR-Cas9技术CRISPR/Cas9技术发展史CRISPR英雄谱背后的故事启发1.1CRISPR/Cas9技术发展史CRISPR的发现CRISPR/Cas系统的生物学作用CRISPR/Cas系统的作用机制CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9技术的发展与应用莱德伯格奠定细菌遗传学基础，从而使简单的细菌成为分子生物学模式生物；科恩伯格则奠定细菌分子生物学酶学基础，开创酶学研究科学范式；桑格则于1977年发明基因测序方法，从而使基因测序成为常规研究内容。技术发展史---CRISPR的发现20世纪50年代开始的微生物遗传学、生物化学和基因组学，三位大师级科学家莱德伯格(JoshuaLederberg)、科恩伯格(ArthurKornberg)和桑格(FrederickSanger)为此做出了奠基性贡献。CRISPR-Cas系统的发现则开始于细菌测序。1987年，日本微生物学家石野良纯(YoshizumiIshino)实验室对大肠杆菌的碱性磷酸酶同工酶(alkalinephosphataseisozyme,iap)进行测序，意外地发现终止密码子后的非编码区存在一些异常重复序列。异常原因：一方面原核生物如细菌的DNA利用率较高，重复序列较少；另一方面传统的重复序列常为串联重复，而这次发现却是“重复-居间序列(spacer)-重复”这一排列特征.技术发展史---CRISPR的发现技术发展史---CRISPR的发现20世纪80年代末，西班牙阿利坎特大学(UniversityofAlicante)的博士生莫伊察(FranciscoMojica)在一种嗜盐古菌(Haloferaxmediterranei)中也发现一类“重复-居间序列-重复”特征序列。为便于进一步研究，将其命名为短规律间隔重复(shortregularlyspacedrepeat,SRSR)2002年，荷兰乌得勒支大学(UtrechtUniversity)的詹森(RuudJansen)进一步发现多个微生物中存在这种特殊结构，并且不同物种的重复序列碱基数存在巨大差异；序列只在原核生物存在，而病毒和真核生物均缺乏。将这种特殊结构重新定义为成簇规律性间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)命名为CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgene,Cas)技术发展史---CRISPR-Cas系统的生物学作用2005年，来自西班牙和法国的三个研究小组几乎同时报道了一个重大发现：通过对CRISPR居间序列的系统分析，意外发现它们并非原核生物自身序列，而是来自病毒或质粒。NCBI进化生物学家库宁（EugeneKoonin)很获悉CRISPR的居间序列来自病毒DNA后，库宁立刻意识到细菌可利用CRISPR作为一种防御病毒侵染的重要武器。CRISPR研究的根本转折：技术发展史---CRISPR-Cas系统的生物学作用库宁提出解释CRISPR-Cas作为获得性免疫系统的作用机制：细菌通过特定方式获取噬菌体DNA片段并将其整合到自身CRISPR重复序列之间形成居间（间隔）序列，从而对外源入侵病毒产生“记忆”；这些序列可被转录出非编码RNA；当噬菌体再次感染时，这些RNA可依靠居间序列信息识别并破坏入侵者。技术发展史---CRISPR-Cas系统的生物学作用巴兰古在霍瓦特(PhilippeHorvath)等协助下首先利用两株噬菌体(P1和P2)侵染链球菌，结果杀死大部分细菌，但仍有部分“幸运”细菌保留下来，且当它们被进一步培养时会获得噬菌体抗性。对这些抗性细菌的基因组分析表明，其CRISPR居间序列中出现噬菌体序列，与P1序列一致则对P1产生抗性，若与P2序列一致则对P2产生抗性，而如果为两株噬菌体公用序列，则对两株噬菌体均产生抗性。当将抗性细菌去除噬菌体序列则导致抗性消失，相反直接将噬菌体序列整合到未感染过噬菌体的细菌CRISPR中，细菌对首次噬菌体感染产生抗性。这是首次在实验上证实CRISPR-Cas是一种细菌获得性免疫系统。巴兰古等的发现既是CRISPR-Cas系统研究的一个里程碑，也是一个转折点和分水岭技术发展史---CRISPR-Cas系统的作用机制2011年，卡彭蒂耶首次阐明tracrRNA在crRNA加工中的作用：tracrRNA与转录出的CRISPR重复序列互补结合，这种结合在Cas9因子存在前提下被RNA酶Ⅲ识别和剪切，最终产生成熟crRNA。这一发现具有十分重要的意义，相对于其他CRISPR系统往往需要一种crRNA但同时需多种Cas9蛋白参与，这一系统(Ⅱ型)则需两种RNA(crRNA和tracrRNA)，虽增加RNA数量，却只需一种Cas9蛋白完成。这个系统如此简单，卡彭蒂耶意识到可将其改造为一种强有力的遗传操作工具用作基因编辑。技术发展史---CRISPR-Cas9基因编辑技术2005年，原核生物CRISPRCas系统的获悉已有推测：采用RNA干扰方式杀死病毒，但详细机制可能不同于真核细胞2007年，巴兰古等CRISPR-Cas系统的细菌免疫作用的发现借助结构生物学方法探索这一新型“RNA干扰”中酶的作用机制杜德娜细菌CRISPR-Cas系统的青年研究小组先后确定Cas蛋白拥有DNA酶活性、RNA序列依赖的DNA核酸内切酶活性、crRNA加工活性等。杜德娜小组确定CRISPR-Cas是一种可对特定DNA序列进行定向剪切的细菌防御系统技术发展史---CRISPR-Cas9基因编辑技术2011年，杜德娜对这种简单的Ⅱ型系统特别是tracrRNA很着迷，而卡彭蒂耶则对Cas9作用机制更感兴趣。一位RNA专家(卡彭蒂耶)与一位酶学专家(杜德娜)的鼎力合作实现了最大程度的优势互补，而CRISPR-Cas9技术简单而言就是RNA(sgRNA)和酶(Cas9)。卡彭蒂耶和杜德娜的发现既是细菌获得性免疫系统领域研究的里程碑，又是基因编辑领域的里程碑。技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用2013年，哈佛大学张锋和丘齐(GeorgeChurch)则进一步在哺乳动物细胞内完成特定基因的编辑，特别是可利用多个sgRNA而实现多基因同时敲除，从而极大提升了编辑效率和适用范围。特异性DNA识别域+非特异性核酸内切酶的三大工具第一代1996：ZFN（锌指核酸酶）（ZincFingerNuclease）第二代2011：TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease）第三代2013：CRISPR（成簇规律间隔短回文重复技术）GenomeEditing技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用主要应用领域技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用ZFN（锌指核酸酶)：由FokI限制性核酸内切酶当中的非特异性DNA切割结构域和锌指蛋白组合而成的。DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成（一般3-4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）：主要由FokI内切酶结构域和TALE蛋白的DNA结合结构域组合而成。DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用CRISPRClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列；研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现；存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点；能够为自身提供一种特异性免疫保护机制，抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。技术发展史---CRISPR-Cas9技术的发展与应用CRISPR-Cas9技术本身不仅取得巨大成功，还推动基因编辑新工具的层出不穷，出现了一系列改进版和更新版。Cpf1与Cas9类似，也是一种RNA依赖的DNA核酸内切酶，但在剪切靶DNA时只需crRNA参与，而无需tracrRNA辅助，用做基因编辑时可大大缩短引导RNA长度，因此CRISPR-Cpf1系统将更为简单。Argonaute蛋白(Ago)系统(不同于CRISPR/Cas系统只存在于原核生物，Argonaute蛋白从原核生物到真核生物都普遍存在，并且在真核生物RNA干扰过程中的作用机制已得到全面研究)也可发挥免疫作用以抵御质粒等外源DNA入侵，暗示着也可被改造为基因编辑工具。单/多重基因敲除基因敲入大片段删除转录调控基因标记应用CRISPR-Cas9技术的应用基因检测1987CRISPR的发现CRISPR广泛存在与原核生物中200020022005CRISPR的命名Cas基因的定义间隔序列适应性免疫系统确定PAM第一次证实CRISPR的作用：获得性免疫20072009201120082010201220132014Spacers转录形成crRNA指导Cas靶向性CRISPR靶点是DNATypeIII-BCRISPR能够对RNA切割Cas9蛋白由spacersequencos和cleaves引导识别靶序列进行切割造成DSBtracrRNA与crRNA形成二聚体并与Cas9组成复合体体外证实Cas能够对DNA切割第一次证实CRISPR可以用于哺乳动物的编辑证实编程CRISPR/Cas9蛋白复合物在序列特异性的靶位点识别并切割RNAtracrRNA(反式作用CRISPRRNA)crRNA(CRISPRRNA)DSB(Double-strandbreaks）PAM（ProtospacerAdjacentMotif）Ishinoetal.Mojicaetal.Jansenetal.Pourceletal.Mojicaetal.Barrangouetal.Marraffinietal.Brounsetal.Haleetal.Bolotinetal.Jarneauetal.CharpentierDoudnaZhangFengsummaryCRISPR/CAS9技术发展历史2015年设计改造了革命性的CRISPR-Cas9基因编辑系统，大大减少了“脱靶”编辑错误（Broad研究所和McGovern脑研究所的研究人员）。2016年利用CRISPR干扰技术，对枯草杆菌的必需基因进行了全面的功能分析（斯坦福大学、加州大学旧金山分校的研究人员）2017年发现一种广谱的CRISPR/Cas9抑制剂（美国加州大学伯克利分校、马萨诸塞大学医学院、哈佛医学院和加拿大多伦多大学的研究人员）。2018年鉴定出CRISPR基因组工程工具包中的一个重要的新组分。（苏格兰圣安德鲁斯大学的研究人员）。1.2CRISPR英雄谱背后的故事启发TheHeroesofCRISPR科学家的科研环境科研环境灵感与规划纯粹好奇心与实践运用“无假设驱动”与“假设驱动”的研究方法个人与团队新颖的视角和深厚的专业知识科学家主要贡献科研环境FranciscoMojicaCRISPR的发现者在地中海嗜盐菌中发现了聚集的规律插入间隔回文重复并其命名为CRISPR在20种微生物上发现了CRISPR基因位点发现CRISPR是一种适应性免疫系统纯粹好奇心无假设驱动新颖的视角深厚的专业知识GilesVergnaud及同事在鼠疫杆菌样本中发现CRISPR基因位点，推断出CRISPR基因位点是在执行防御机制实践运用无假设驱动深厚的专业知识AlexanderBolotin第一个提出了CRISPR是如何提供免疫功能的设想深厚的专业知识PhilippeHorvath及同事检验确认CRISPR是一种适应性免疫系统这一假设证明免疫功能就是依赖间隔与目标物之