Axygen-mini-prepare-质粒提取试剂盒说明书

09/05Ver.1爱思进生物技术（杭州）有限公司电话：[phone]传真：[phone]E-mail:[e-mail]碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从1-4ml细菌培养物中提取多至20μg高纯的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。一、试剂盒组成、贮存、稳定性Cat.No.AP-MN-P-4AP-MN-P-50AP-MN-P-250制备次数4preps50preps250preps制备管4502502ml离心管4502501.5ml离心管450250RNaseA10μl30μl150μlBufferS12ml15ml75mlBufferS22ml15ml75mlBufferS32.5ml21ml105mlBufferW12.8ml28ml135mlBufferW2concentrate2.4ml24ml2×72mlEluent1ml5ml25ml说明书111RNaseA：50mg/ml，室温可贮存6个月，长期贮存于-20°C。BufferS1：细菌悬浮液。加入RNaseA后，混合均匀，4°C贮存。BufferS2：细菌裂解液（含SDS/NaOH），室温密闭贮存。BufferS3：中和液，室温密闭贮存。BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。BufferW2concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或95%乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。Eluent：2.5mMTris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。二、注意事项BufferS2、BufferS3和BufferW1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。09/05Ver.1爱思进生物技术（杭州）有限公司电话：[phone]传真：[phone]E-mail:[e-mail]三、实验准备1.第一次使用前，RNaseA全部加入BufferS1中，4°C贮存。2.准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。3.第一次使用前，BufferW2concentrate中加入指定体积的无水乙醇。4.使用前，检查BufferS2是否出现沉淀，应于37°C温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。四、操作步骤第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到BufferS1中，混合均匀，4°C贮存。1.取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g离心1min，弃尽上清。2.加250μlBufferS1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。*确认BufferS1中已加入RNaseA。3.加250μlBufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。*BufferS2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。*避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。*此步骤不宜超过5min。4.加350μlBufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。*避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。步骤5～7可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。A.负压法5A.将质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。6A.加500μlBufferW1，吸尽管中溶液。7A.加700μlBufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。*两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。8A.将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1min。09/05Ver.1爱思进生物技术（杭州）有限公司电话：[phone]传真：[phone]E-mail:[e-mail]中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000×g离心1min，弃滤液。6B.将制备管置回离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心1min，弃滤液。7B.将制备管置回离心管，加700μlBufferW2，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。弃滤液。*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。*两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。8B.将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。9.将制备管移入新的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80μlEluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min。*将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。五、流程图加250μlBufferS1加250μlBufferS2加350μlBufferS3加500μlBufferW1加700μlBufferW2加700μlBufferW2加60-80μlEluent或去离子水裂解中和结合洗涤洗脱