流式细胞术应用概述分析解析

流式细胞术应用概述流式细胞术系列讲座之——概述流式细胞术的一般介绍流式细胞术在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用凋亡分析血液学检测和科研应用其它应用主要内容流式细胞术的一般介绍第一部分什么是流式细胞术？流式细胞仪(FlowCytometer):是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。流式细胞仪特点多参数测量和分析（散射光和荧光）；快速测量和分析每秒可达1000-10000个细胞分选纯度可达99%以上。获取的数据分析结果更具有统计学意义；通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度流式细胞仪分析数据常见图形：（二维）点阵图(DotPlot)适用于：双参数分析流式细胞仪分析数据常见图形：直方图(HistogramPlot)适用于：单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化流式细胞仪分析图谱SSC（侧向散射光）--反应细胞内颗粒多少FSC（前向散射光）--反应细胞大小散射光信号特征信息－荧光（Fluorescence）信号FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）流式细胞仪分析图谱双色直接染色设门：选择要分析的细胞群体设定阴性、阳性范围流式细胞术在临床检测和科研中的应用第二部分一、免疫学检测和科研应用1、细胞表面分子标记（以淋巴细胞亚群检测为例）原理人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞两个亚群；B淋巴细胞特异性标志为CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进而得到各亚群的比例。T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells淋巴细胞亚群及功能T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高CD4+CD25+CD127-/FoxP3+调节性T细胞（Treg)具有免疫抑制作用CD4+CD25+CD127-Treg检测活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞NK细胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆淋巴细胞亚群及功能淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等疾病预防淋巴细胞亚群检测意义Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鉴别活动期和非活动期SLE2、胞内分子流式细胞术检测（以Th1/Th2细胞因子检测为例）Th1/Th2细胞Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr流式细胞术检测胞内细胞因子新鲜分离PBMC加PMA＋Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-Th1/Th2失衡相关疾病－胞内寄生的病原生物感染性疾病Th1细胞及其细胞因子⇑－保护性免疫Th2细胞及其细胞因子⇑－发病，如结核病，或慢性感染－变态反应性疾病Th2细胞及其细胞因子⇑－过敏性哮喘等（IgE⇑）－自身免疫性疾病Th1细胞及其细胞因子－常为炎性增强的标志Th2细胞及其细胞因子－免疫耐受/抑制有关－肿瘤免疫Th2细胞及其细胞因子⇑－肿瘤发病，Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用Th1和Th2相关的细胞因子IFN-治疗麻疯病用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物:萨力多胺(Thaliodomide)治疗巨细胞动脉炎疾病治疗监测二、流式细胞术在肿瘤学中的应用肿瘤发生发展1、DNA倍体和细胞周期分析细胞周期和DNA倍体分析的原理G0/G1期DNA含量为2CS期细胞,DNA含量开始增加,2CG2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平2、性细胞DNA含量为1C3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量Diploid:100.00%DipG1:54.38%at46.90DipG2:15.91%at91.61DipS:29.71%G2/G1:1.95%CV:5.23DebrisAggregatesApoptosisDipG1DipG2DipSG0/G1SG2/MDiploid:64.50%DipG1:92.45%at49.24DipG2:2.30%at98.48DipS:5.26%G2/G1:2.00%CV:3.21Aneuploid1:35.50%An1G1:97.69%at58.53An1G2:0.00%at123.89An1S:2.31%G2/G1:2.12%CV:3.14DI:1.19DebrisAggregatesDipG1DipG2DipSAn1G1An1G2An1S可检测标本新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。蜡块包埋的标本需进行特殊处理意义70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症--早期(I/II期)DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,19992、肿瘤相关基因编码蛋白检测P53乳腺癌与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关大肠肿瘤早期发现大肠癌胃癌与预后相关肝细胞癌与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达造血系统细胞—淋巴,单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮—前列腺上皮,子宫内膜等干细胞或增值细胞—皮肤的基底细胞,肠上皮寿命长的分裂细胞—神经元胚胎组织Bcl-2在肿瘤组织中的表达肾脏肿瘤—肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤前列腺癌B细胞性淋巴瘤乳腺癌(43%)甲状腺癌nm23nm23与多种肿瘤的转移及预后相关肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤CD44(CD44s/CD44v)人体肿瘤CD44亚型与肿瘤的临床相关性肺癌非特异总CD44表达的下调与较差的预后相关胃肠道癌CD44v9胃肠道肿瘤的独立的预后指标CD44v8-v10与肝转移相关,并为结直肠癌的独立的预后指标CD44v6与肠癌的浸润相关恶性黑色素瘤CD44v5与侵润性相关乳腺癌CD44v6受雌激素和孕激素调控CD44v3/v4,CD44v6肿瘤分级,但不是独立的预后指标CD44s,CD44v6肿瘤分级,但不是独立的预后指标甲状腺癌(乳头型)CD44v6与淋巴节转移相关非何杰金氏淋巴瘤CDv3,v6,v9与较差预后相关神经母细胞瘤CD44s总CD44表达的下调与较差的预后相关3、Cyclin(细胞周期蛋白)检测P-gp在肿瘤组织中的表达乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等化疗前高表达化疗后高表达肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等化疗前低表达非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等化疗不敏感化疗敏感化疗不敏感4、肿瘤多药耐药性(MDR)检测4、凋亡检测详见下一部分三、流式细胞术分析凋亡细胞凋亡与疾病的关系——该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染不足与过度并存：动脉粥样硬化凋亡与疾病细胞凋亡过程在凋亡诱导因素的作用下线粒体的膜电位改