抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托（3）100μmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1各溶液加入量试剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/LMet溶液750μmol/LNBT溶液100μmol/LEDTA-Na2液20μmol/L核黄素酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.050.253.013mmol75μmol10μmol2.0μmol空白和对照管加缓冲液代替酶液加核黄素时记得要快并且要避光，SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：SOD总活性=1005.0)(VFWAVAATS式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；A0—照光对照管的消光度值；AS—样品管的消光度值；VT—样液总体积（ml）；V1—测定时样品用量（ml）；FW—样重（g）；蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。用荧光灯20w照20min可以吗不可以,二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)61.5ml和B母液(NaH2PO4)438.5ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反应混合液配制：取50mlPBS(100mmM，pH6.0)，加入28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入19ul30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。取试管3支，一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3ml反应液并加入1ml酶液，立即计时，在470nm测定，酶隔30s读书一次。测一个样加一个，不要全部加上。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)61.0ml和B母液(NaH2PO4)39.0ml混合后至100ml。(加1gPVP)（2）反应液配制：吸取5.68ml30%的H2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可。（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用.2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号粗酶液(ml)pH7.8磷酸(ml)蒸馏水(ml)S10.21.51.0S20.21.51.0S30.21.51.025℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液（pH=7.8）3.结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性(u/g/min)=A240×Vt/0.1×V1×t×FW式中A240=AS0－（AS1+AS2）/2AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g三氯乙酸→1L0.6%TBA：0.6g硫代巴比妥酸,加少量氢氧化钠（1mol/l）溶解→用10%TCA定容100ml（避光）1mol/l氢氧化钠；称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml3、测定步骤:称取剪碎的试材1g，加入2ml10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆离心（4000r）离心10min，上清液为样品提取液。3.显色反应和测定吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。(2)双组分分光光度法按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA（μmol/gFW）＝C2(umol/L)=6.45*(D532－D600)－0.56*D450C2－为MDA的浓度；D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取0.001g考马斯亮蓝，溶于50ml90％乙醇中，加入100ml85％（W/V）的磷酸（不懂），85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是85%的磷酸，加入100ml就行。再用蒸馏水定容到1Ｌ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mgBSA加水溶解后定容至100ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。吸取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。调零管是用蒸馏水样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VT/(V1×FW×1000)（2-2）式中C：查标准曲线值(μg)；VT：提取液总体积(Ml)；ＦW：样品鲜重(g)；V1：测定时加样量(Ml)。我就测这五个所以帮下我谢谢。