细胞培养技术实用篇

细胞生物学技术第三章细胞培养基本技术王云动脉粥样硬化研究所细胞培养的优点活细胞：长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构和生命活动可控制：选择特定的细胞种类、性质、阶段可控制调节条件：物理、化学、生物等可采用各种研究技术、记录方法样品均一性：来源于同一组织同一种细胞经济、规模局限性人工模拟的条件和体内实际情况仍不完全相同缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响体外培养的细胞生活在缺乏动态平衡的环境环境中，必然发生变化。本章主要内容细胞培养的基本操作技术原代培养(primaryculture)传代培养(subculture)体外培养细胞的影响因素细胞培养污染及对策培养细胞的生长测定方法细胞冻存和复苏细胞培养中的常用术语组织培养(TissueCulture)：指的是从体内取出组织，模拟体内生理环境，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养（OrganCulture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。细胞培养(CellCulture)：培养物是单个细胞和细胞群。细胞培养中的常用术语原代培养（primaryculture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。传代（passage）也称再培养。无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系细胞培养中的常用术语细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。接触抑制（contactinhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象一、细胞培养基本操作技术由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。培养前准备制定好实验计划和操作程序有关数据的计算要事先做好。准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置在操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。消毒地面每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。消毒时工作台面上用品布局合理，不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着装原则上和外科手术相同。仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。专用鞋或带鞋套火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。如实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。操作进行培养时，动作要准确敏捷不能太快，否则空气流动增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。组织细胞取材及培养的基本要求取材的组织用培养液浸泡，4℃运送，24h内尽快培养。取材时应严格无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的培养液。一般来讲,胚胎组织较成熟个体的组织容易培养;分化低的较分化高的组织容易生长;肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。为了便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养与原组织的差异性，原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。组织材料的分离机械法：适于较柔软的组织，如脑、脾、淋巴结、胸腺等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆器研磨或用注射器针芯挤压后过不锈钢筛网。化学法：胰蛋白酶、胶原酶、EDTA法细胞悬液的分离方法：低速离心法、密度梯度离心法细胞悬液的分离方法低速离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm离心5-10min。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的细胞。常用介质有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。胰蛋白酶（TRYPSIN）对细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。消化效果与PH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关。适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用。钙镁离子和血清抑制其活性。常用剂量为0.25%，PH8，温度37℃胶原酶法（COLLAGENASE）水解结缔组织中胶原蛋白成分，对上皮细胞影响不大。产品有ⅣⅦⅨ等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞及纤维组织。钙镁离子和血清不影响活性，PH6.5-7常用剂量为200U/mlEDTA法EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，可与胰蛋白酶混合使用(1：1或2：1)，既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。EDTA工作液的浓度为0.02％，用不含钙、镁PBS配制。二、原代培养(PRIMARYCULTURE)从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养，即将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。原代培养细胞组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实验的很好对象；原代细胞培养也是建立各种细胞系（cellline)或细胞株（cellstrain）必须经过的阶段。原代细胞培养多由各种细胞成分组成，比较复杂，即使是经过处理后的细胞，也仍具有异质性（heterogeneous),主要表现在细胞形态和大小不一原代培养的方法悬浮细胞培养法器官培养法组织块培养法细胞培养法悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞．如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化，可采用低速离心分离,直接培养。器官培养(ORGANCULTURE)指组织、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长，它们可以分化与保持原来的结构与功能。细胞培养法方法与步骤1)动物处死：将出生2～3d乳鼠，用脱颈方法处死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切：在无菌条件下将组织取出，置于无菌培养皿中，剪去多余的组织（脂肪等），用PBS液洗涤1-2次；放入另一培养皿中，将组织剪成1mm3大小的块。细胞培养法方法与步骤3)消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌试管内，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出试管，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。细胞培养法方法与步骤4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出适量滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含3～5×105个细胞为宜。5)分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶or培养皿中，盖好，做好标记，置于37℃CO2培养箱中培养。6)观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。细胞培养法注意事项取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡；取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。3.取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中；组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故也被称为组织培养(tissueculture)。组织块培养法(1)取材、修剪、组织剪或切成1mm3左右的小块。(2)将剪切好的组织小块用眼科镊送入培养瓶内。25ml培养瓶(底面积约为17.5cm2）以20一30小块为宜。(3)放置2—4h待组织小块贴附后．将培养瓶慢慢翻转平放、静止培养注意事项组织块接种后l-3天，游出细胞数很少,组织块的粘贴不牢固。观察、移动过程中要注意动作轻巧。尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。在原代培养的1-2d内要持别注意观察，是否有细菌、霉菌的污染。一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其它细胞带来污染。原代培养3-5d需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞，以免影响原代细胞的生长。几种细胞的原代培养图示1.细胞种类：人肺部成纤维细胞；2.培养的天数：2D-4D-7D;3.放大倍数：200倍；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，贴壁生长;几种细胞的原代培养图示1.细胞种类：小鼠胚胎成纤维细胞2.培养的天数：4d；3.放大倍数：倒置显微镜；4.培养基种类：1640+10%X小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈长梭形，贴壁生长几种细胞的原代培养图示神经元原代培养:神经元是高度分化的细胞,在体外培养条件下难以增殖.因此,目前神经元的培养主要用于原代培养.神经元胞体呈圆形或长杆状,核大而圆,核仁明显.可见有细小突起从胞体长出.培养液中需加入高浓度的葡萄糖,以利于神经元的生长.三、传代培养(PASSAGEORSUBCULTURE)细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。不论是否稀释，将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养(passage)。细胞的传代培养根据细胞生长的特点，传代方法有2种。悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。细胞的传代培养贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。在传代时，需要用胰蛋白酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用EDTA溶液与胰蛋白酶按1：1或2：1比例混合后联合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。Optimalconfluencyformovingcellstoanewdishis70-80%toolow,cellswillbeinlagphaseandwon’tproliferateToohighandcellsmayundergounfavorablechangesandwillbedifficulttoremovefromplate贴壁生长细胞传代方法酶消化过程酶消化过程注意问题操作全过程注意无菌操作胰酶消化时间要适度吹打细胞时用力要适度，尽量减少气泡贴壁生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期