样品前处理技术基础理论

©2008WatersCorporation样品前处理技术基础理论©2008WatersCorporation2培训概要样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四©2008WatersCorporation3样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四©2008WatersCorporation4样品前处理的重要性重要性由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样品制备方法和技术是一个重要问题。©2008WatersCorporation5为何需要样品前处理?SampleProcessing61%DataManagement27%Analysis6%Collection6%样品前处理所消耗时间样品处理数据处理检测分析收集整理©2008WatersCorporation6对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器,适当的样品前处理对于减少基质干扰和富集组分至关重要！为何需要样品前处理?60%以上的工作和费用花费在样品前处理上三个目的:除去样品基质中的干扰物富集组分增强仪器的性能高效液相色谱；液质联用©2008WatersCorporation7样品前处理原则原则①制备过程中避免组分发生化学变化；②要防止和避免欲测定组分的沾污；③尽可能减少无关化合物引入制备过程；④尽可能简单易行。©2008WatersCorporation8样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四©2008WatersCorporation9样品处理一般性步骤离心过滤液-液萃取SPE(固相萃取)SPME(固相微萃取)……根据样品类别和被分析物的结构、极性等理化性质选择合适的提取溶剂GCGC-MSHPLCLC-MSCE……提取净化测定气相色谱气质联用液相色谱气质联用毛细管电泳©2008WatersCorporation10样品前处理的重要性及原则一样品前处理方法及比较二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四©2008WatersCorporation11样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护溶剂置换©2008WatersCorporation12样品的预处理重要性占样品分析时间的比例—样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大—消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节—影响实验结果好坏的最重要因素ë是决定性的步骤©2008WatersCorporation13常见样品前处理方法常见样品前处理包括:液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品前处理沉淀©2008WatersCorporation14样品前处理的各种方法方法选择性基础沉淀溶解度液—液萃取样品在两相中的分配固相提取样品在吸附剂上的吸附与分配渗析/超滤分子量与体积电泳电荷/淌度蒸馏/蒸发沸点与蒸气压©2008WatersCorporation15©2008WatersCorporation16样品前处理的各种方法方法：沉淀法选择性基础：溶解度©2008WatersCorporation17样品前处理的各种方法方法：液—液萃取选择性基础：样品在两相中的分配©2008WatersCorporation18渗透©2008WatersCorporation19©2008WatersCorporation20蒸馏©2008WatersCorporation21传统的样品前处理方式液液萃取(LLE)根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物从一相提取至另一相中。装置简单操作容易常被认定为成本低廉费时费力常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显著偏差(常在10%~20%之间)若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。注:大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影响，并可带来火灾隐患有机层水层©2008WatersCorporation22传统的样品前处理方式蛋白质沉淀法(PPT)1-吸取200L血浆2-加入400-600l乙腈3-高速混合4-离心取上清液5-以水稀释后进样在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除简单快速可被自动化，适用于高通量分析若检测限要求不高时较适用属快速但粗糙的净化技术，仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（此为LC/MS分析时遭遇离子抑制的根源!）分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗导致样品稀释,不适合用于超痕量分析场合进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分析重现性不佳)©2008WatersCorporation23固相萃取技术(SPE)先进的样品前处理方法可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品分析结果呈高度可靠性使得检测灵敏度和选择性大大提高明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少分析结果的精密度提高(偏差常5%)多样化的产品设计迎合不同样品通量要求依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将其从液相提取至固定相中（本质上为色谱分离方法）©2008WatersCorporation24样品前处理的重要性及原则一样品前处理方法及比较二样品前处理一般性步骤三固相萃取技术四©2008WatersCorporation25概念固相提取（SolidPhaseExtraction，SPE)是一种重要的样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展起来的。利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。©2008WatersCorporation26原理及特点利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小差异实现净化分离。与传统的液液萃取相比具有明显的优势。特点回收率、富集倍数高有毒溶剂用量少两相分离操作简单、易自动化更有效的是分析物与杂质分离©2008WatersCorporation27应用领域已被广泛的应用于：化学、化工行业制药行业临床医学研究食品安全领域烟草行业环境保护中草药研究……©2008WatersCorporation28©2008WatersCorporation29固相提取技术SolidPhaseExtraction(SPE)色谱填料颗粒填装小柱1978年由Waters首次推出商品化产品：“Sep-PakCartridges”SampleEnrichment&Purification•非常成熟的技术•数千化合物的参考文献•洗脱剂•废液•0.01to1000克•多种规格©2008WatersCorporation30梨的色谱分析：SPE的作用不同提取过程的结果比较乙腈提取未净化乙腈提取用水稀释Oasis®HLB提取乙腈提取用水稀释Oasis®HLB提取用Sep-Pak®氨基小柱净化©1999WatersCorp.©2008WatersCorporation31固相提取技术SolidPhaseExtraction(SPE)两相——液相与固相—容易分离—多种吸附剂可供选择o反相－最常用！o正相o离子交换o具有高选择性的新型吸附剂—溶剂消耗少—与液液提取相比—减少人力与时间—容易自动化液相色谱基础©2008WatersCorporation32HPLC与SPE之区别HPLCSPE颗粒直径~5µm40-80µm柱床效率highlow柱外体积lowhigh柱长5-30cm~1cm塔板数(N)~10,00050Bottomline:HPLCcanseparatesimilarcompounds.SPErequiresasignificantselectivitydifferencebetweencompoundsforseparation.CompoundsnotwellresolvedbyHPLCcannotbeseparatedbySPEwithasimilarretentionmechanism.©2008WatersCorporation33分离效率比较-HPLC与SPE00.20.40.60.810510152000.20.40.60.8105101520Elutionvolume(洗脱体积)(mL)Normalizedconcentration©2008WatersCorporation34常见固相提取小柱的构造色谱柱床(吸附剂)柱体过滤膜/筛板插口/出液口©2008WatersCorporation35SPE产品常见形式萃取小柱:•小柱体积1~35ml,吸附剂重量10mg~6g•为中等数量样品设计•食品安全、环境分析和研究实验室96-孔板:•吸附剂重量2~60mg•为高通量分析设计（DMPK/BA/BE实验室）•μElution板用于微量样品和高灵敏度分析在线SPE净化柱:•柱芯式(需SentryGuard套件)和标准柱•由切换阀和软件控制，无需人工操作©2008WatersCorporation36固相提取技术的基本要求样品必须呈液态驱动力(DrivingForces)－操作方式—重力—压力—真空©2008WatersCorporation37SPE技术的驱动力：重力重力©2008WatersCorporation38SPE技术的驱动力：压力压力©2008WatersCorporation39SPE技术的驱动力：压力注射器接头—adaptor提取小柱压力©2008WatersCorporation40ResevoirwithAdapterSPE技术的驱动力：真空©2008WatersCorporation41SPE技术—填料颗粒基质硅胶基质—键合各种官能团—如，{C18,C8,NH2,QMA...}—不规则填料o小柱(Cartridges)：40-80moDisks：8-10m活性碳(AC2)表面衍生剂涂层(DNPH)聚合物基质(最新技术)—Oasis—球形填料—30/60m©2008WatersCorporation42SPE填料的类型正相填料—溶剂：正己烷—填料：硅胶（Silica）氧化铝,Florisil®,氨基,二醇基,……反相填料—溶剂：MeOH/水—填料：C18/C8/OasisHLB离子交换填料—溶剂：缓冲液/盐流动相—填料：AccellCM/AccellQMA/OasisMCX/MAX/WAX/WCX©2008WatersCorporation43SPE各种填料固定相官能团C18–Si(CH3)2C18H37tC18–SiC18H37C8–Si(CH3)2C8H17tC2–SiC2H5PorapakRDX-divinylbenzene/vinylpyrrolidoneAminopropyl–Si(CH2)3NH2Cyanopropyl–Si(CH3)2(CH2)3CNDiol–Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OHAccellPlusCM–COO2–Na+AccellPlusQMA-–C(O)NH(CH2)3N(CH3)+Cl–DNPH-dinitrophenylhydrazineOasisHLBOasisMCXOasisMAXOasisWCX,WAX-divinylbenzene/vinylpyrrolidone-divinylb