第十三章-多肽与蛋白质类药物

第十三章、多肽与蛋白质类药物主要内容：多肽与蛋白质类药物的生产方法多肽类药物蛋白质类药物第一节、多肽及蛋白质类药物的生产方法一、蛋白质类药物的分离与纯化：（一）材料选择：来源有动植物组织、微生物等，原则上是选择富含目的蛋白质或多肽成分的、易于获得和易于提取的无公害生物材料。对于天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求。比如：（1）种属：如牛胰含胰岛素单位比猪胰高，而牛胰岛素的抗原性比猪胰岛素抗原性高。（2）发育阶段：如幼年动物胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。HCG在妊娠妇女60-70天的尿中达到高峰，等等。（3）生物状态：如饱食后胰岛素含量高；严重再生障碍性贫血患者尿中的EPO含量高，等等。（4）原料来源：如血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并饿二致，而稳定性以颚下腺来源为好。（5）原料解剖学部位：如猪胰脏中，胰尾部位含激素较多。而胃膜素以采取全胃黏膜为好；胃蛋白酶则以采取胃底部黏膜为好。（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求：主要是考虑表达量、后处理的难易等。（二）蛋白质提纯的一般方法：1、根据等电点的不同来纯化蛋白质有等电点沉淀法、等电点沉淀和盐析法联用法、等电点聚焦法等2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质有凝胶过滤法、超滤法、离心法、透析法等3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法、低温下有机溶剂沉淀法4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质主要是离子交换层析法，有不同的离子交换剂和不同的交换层惜条件5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质主要手段是亲和层惜法6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质可用疏水柱或反向HPLC来纯化7、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质主要是逆流分溶法（原理类似于萃取）8、根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质利用不同蛋白质变性条件不同来分离不同的蛋白质9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质一些特殊的吸附层析法，如羟灰石、硅藻土、氧化铝、活性炭等吸附10、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质如SOD能抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其它蛋白质，以便于SOD的进一步纯化（三）蛋白质的分离和纯化1、时间因素：纯化处理的时间要控制好2、选择离子交换层析条件的程序：如离子交换剂的选择及其使用条件的选择3、蛋白质分离纯化的可能的技术手段的组合：（略）（四）溶液中蛋白质浓度的测定凯氏定氮法化学反应法双缩脲法福林-酚反应法氨基黑测定法染色法考马斯亮蓝测定法氯胺T测定法灵敏度较高的方法紫外吸收法放射性同位素测定法1、紫外吸收法（1）280nm光吸收法取3ml蛋白质溶液，以缓冲液作为对照，用光径为1cm的石英比色皿，在280nm处测定吸收值；以浓度1mg/ml的蛋白质溶液的A280为1.0进行估算；也可根据文献查得相关蛋白质的标准值，再计算。（2）280nm和260nm的吸收差法当蛋白质溶液中含有核酸时，可用此方法进行测定。分别测得A280和A260值，再按下列公式计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280–0.74260（3）215nm和225nm的吸收差法对于稀溶液中蛋白质浓度的测定可用此法。测得溶液的A215和A225值，再用下列经验公式进行计算：蛋白质浓度（mg/ml）=0.144（A215–A225）2、双缩脲法（1）常用双缩脲法蛋白质分子可与铜离子反应形成紫红色化合物，在540nm处比色测定，可测定蛋白质浓度。本法测定范围为1-10mg/ml。（2）微量双缩脲法利用蛋白质与铜离子形成的化合物在310nm-330nm处的吸收比540nm处的吸收大得多，因此，在蛋白质浓度低时可用测定A310或A330值的方法测定蛋白质浓度。此法比540nm法灵敏10倍以上。3、福林-酚试剂法本方法是双缩脲法的发展。首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物，然后该复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），产生兰色；再用比色法测定A750；测定范围在0.03-0.3mg/ml；或在550nm处比色测定，测定范围为0.05-0.5mg/ml。4、考马氏亮蓝G-250染色法（也有R-250）G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为兰色，可在595nm比色测定。本法反应快、操作简便、消耗样品量少；但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。测定范围为0.01-1.0mg/ml。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有影响。G-250染色能力很强，比色皿一定要洗干净，而且千万记住不能用石英比色皿。（1）溶液配制标准蛋白质溶液配制、染色液配制。(p298)（2）测定方法作标准曲线、测定未知样品、比较、校准。（五）纯度检查常用蛋白质纯度检查方法有：1、HPLC或FPLC法常用的有效方法2、电泳法变性电泳和非变性电泳3、免疫化学法有免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析等，依据是抗体抗原反应。4、生物测定法生物效价测定和生物学功能测定5、分光光度法紫外分光光度法、红外分光光度法二、多肽与蛋白质的化学合成有固相合成法和液相合成法两种；多肽合成的基本步骤有：①氨基保护和羧基活化；②羧基保护和氨基活化；③接肽和除去保护基团。1、保护基团：主要是保护一些活性基团，如-NH2、-COOH、-SH等。氨基保护基是苄氧羰酰氯（Cb2-Cl），与氨基酸或肽上氨基作用形成苄氧羰酰氨基酸（Cb2-氨基酸）或Cb2-肽；可用氢化法或钠氨法还原除去保护基团。也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保护基。羧基保护基常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化；保护基可在皂化反应是除去。精氨酸的胍基用对甲机基磺酰基（Tos-）保护。其它活性基团可用苄基（-B）保护，用钠氨法还原除去保护基团。2、肽的液相合成法：合成多肽的顺序是从C-端到N-端；因为常用羧基活化的方法，而不用氨基活化的方法（氨基活化易发生消旋化）。肽合成法可分为阶梯伸长法和片段缩合法。（1）阶梯伸长法：常用的羧基活化方法是混合酸酐法和活化酯法。NCC法（N，N-二环己基碳二亚胺），首先使N-端保护的氨基酸同DCC反应，形成酸酐后，加入另一氨基酸，缩合成肽。另一常用方法是活化酯法，带有N保护基的氨基酸对硝基芳香族酯，能与另一氨基酸酯的氨基缩合成肽。（2）片段缩合法：由小肽合成大肽时常用叠氮法，而且应该尽量利用Gly和Pro这两个氨基酸的C-末端接肽，这样不易消旋化。3、肽的固相合成法：肽链的延长是在不溶性的聚苯乙烯树脂载体沙锅内完成的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应形成苄酯，然后按照肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。固相合成法比液相法操作简便、时间缩短、可以自动化。4、游离肽的获得：合成多肽后，进行分离纯化，即可得到纯的多肽了。固相法合成多肽示意图第二节、多肽类药物一、主要多肽类药物：1、多肽激素：（1）垂体多肽类激素如促皮质激素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）、催产素（OT）、加压素（AVP）。（2）下丘脑激素如促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH）。（3）甲状腺激素如甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）。（4）胰岛激素如胰高血糖素、胰解痉多肽。（5）胃肠道激素如胃必素、胆囊收缩素-促胰激素、肠必素等（6）胸腺激素如胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子。2、多肽类细胞生长调节因子：表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）3、含有多肽成分的其他生化药物：骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、蜂毒素、蛇毒素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素、脑安肽、助应素、妇血宁等。二、主要多肽类药物的制备：1、胸腺激素：（1）胸腺素（Thymocin）目前已经药用的是胸腺素组分5，由40-50种多肽组成的混合物，分子量在1KDa-15KDa之间。依据它们的等电点分为三个区域：α区包括等电点低于5的组分，β区包括等电点在5-7之间的组分，γ区包括等电点在7以上的组分。（2）工艺路线：工艺过程：提取低温下匀浆、离心，得上清；加热去杂蛋白加热上清至80℃、15min，离心、得上清；沉淀冷至4℃、加-10℃丙酮沉淀，过滤得沉淀，干燥得丙酮粉；分段盐析丙酮粉溶于pH7.0PBS，加硫铵至饱和度0.25，沉淀、离心，得上清；调pH4.0，再加硫铵至饱和度0.50，得盐析物；超滤盐析物溶于pH8.0的10mMTris-Cl，超滤，取分子量在15KDa以下的超滤液；脱盐、干燥超滤液经SephadexG-25脱盐后、冷冻干燥，得胸腺素。（3）检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%；分子量：必须低于15KDa。（4）作用与用途：（自己看看，p305）2、胸腺肽：（1）结构与性质：胸腺肽中主要是分子量为9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达15种，必需氨基酸含量高，还含有少量核酸。对热较稳定（80℃时活性不降低），蛋白酶水解会使之失活。（2）生产工艺：工艺过程：原料处理取-20℃冷藏小牛胸腺，低温下绞碎；制匀浆、提取低温下加冷重蒸馏水（1:1），匀浆，浸渍提取；部分热变性、离心、过滤匀浆液加热至80℃、5min，冷至-20℃、2-3天；融化后4℃离心、微孔滤膜压滤，得澄清滤液；超滤、提纯将上述滤液用分子量截流值为1万以下的超滤膜进行超滤，收取分子量在1万以下的活性多肽，-20℃冷藏。分装、冻干经检验合格后，加入3%甘露醇作赋形剂，用微孔滤膜除菌过滤，分装，冻干即得注射用胸腺肽。（3）检验方法：活力测定同胸腺素；分子量10000以下。（4）作用与用途：（自己看看，p306）2、促皮质素（ACTH）（1）结构与性质：是从垂体前叶提取的一种多肽激素；分子量：人为4567，猪为4593；易溶于水，等电点6.6。100℃加热活性不变。由39个氨基酸组成，种族差异仅仅在第25-33位上，1-24位的片段具有全部活性。可被胃蛋白酶部分水解，但仍有活力。在水溶液中存在着高度α-螺旋。（2）生产工艺：工艺过程：提取垂体前叶干粉加0.5M醋酸20倍，用硫酸调节pH2.0-2.4，70-75℃保温10min，过滤。一次吸附提取液调pH3.1，加投料量20%的CMC，3℃搅拌吸附12h，过滤。CMC用0.15M盐酸解吸，解吸液用717阴离子交换树脂处理，pH3.0以上，过滤，调pH3.1，冷藏。二次吸附在洗脱滤液中再加CMC，1-5℃搅拌吸附12h，过滤，CMC用0.1M醋酸、蒸馏水、0.01M醋酸铵（pH4.6）及0.1M醋酸铵（pH6.7）分别洗涤，最后用0.15M盐酸解吸。解吸液分别用717阴离子交换树脂及732阳离子交换树脂处理，pH调到3.0左右，冷冻干燥得ACTH。（3）检验方法：粗品用小白鼠胸腺萎缩法测定；精品用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。（4）作用与用途：（自己看看）3、降钙素（Calcitonin,CT）（1）结构与性质：是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的滤泡旁细胞（C细胞）分泌。由32个氨基酸残基组成，N-端为半胱氨酸，与7位上的半胱氨酸形成二硫键，C-端为脯氨酸。如果去掉脯氨酸，活性尽失。分子量3.5KDa，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿等。活力可被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、多酚氧化酶、H2O2氧化、光氧化及N-溴代琥珀酰亚胺所破坏。降钙素广泛存在于多种动物体内。在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中。（2）生产工艺：（3）工艺过程（略）（4）检验方法：生物活性测定法：注射大白鼠，1h后收集血清，测定血清钙值（对照标准品测定）。（5）作用与用途：（自己看看）第三节、蛋白质类药物一、主要蛋