分子生物学基本技术

分子生物学基本技术讲授内容一、分子杂交与印记技术二、PCR技术三、基因文库四、DNA测序技术五、芯片技术六、蛋白质相互作用研究一、分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、基本原理（一）印迹技术（二）探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。三种印迹技术的比较分子杂交实验①②③放射自显影照片其他杂交技术：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)斑点杂交（dotblotting）将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。反向斑点杂交（reversedotblotting）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。13原位分子杂交技术原位杂交（insituhybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。荧光原位杂交（FISH）DNA点阵二、聚合酶链反应PolymeraseChainReaction5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR技术原理三、基因文库GeneLibrary•基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)•cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例四、DNA序列测定分析NucleicAcidSequenceAnalysis一、DNA链末端合成终止法二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例五、芯片分析技术BiologicalChipTechnology•DNA芯片(DNAchip)•cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。一、基因芯片基因芯片(genechip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)