12基因工程的基本操作程序1

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获取2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（1）基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）cDNA构建方法-----反转录法基因组DNA文库cDNA文库（3）基因组DNA文库与cDNA文库的构建补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。终止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因表达的计算在真核生物中，对应的是的碱基数DNAmRNA蛋白质转录翻译631氨基酸数碱基数基因中外显子思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因翻译产物蛋白质等特性。注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。多聚合酶链式反应体外特定DNA片段②原理：__________DNA复制③前提条件：_______________________；有一段已知基因的核苷酸序列（二）利用PCR技术扩增目的基因变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸③过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在_____作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链高温④原料：___________、___________、__________________、________________。⑤方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑥结果：四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内大量扩增模板DNAPCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因人工合成(基因比较小，核苷酸序列已知)DNA合成仪从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切割目的基因，使其产生_______________________。将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端或平末端同一种限制酶相同的黏性末端或平末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体——核心2.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料:3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法（最多）基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法（1）农杆菌转化法特点：①易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：常用菌：微生物作受体细胞原因：过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞膜的通透性Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少一定温度重组表达载体DNA溶于缓冲液受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞归纳：四、目的基因的检测与鉴定分子检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平鉴定1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（DNA-DNA)（2）过程:②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；③使探针和基因组DNA杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。（一）检测2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:分子杂交(mRNA-DNA)①方法:抗原-抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。②过程:从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带,表明目的基因已形成蛋白质产品。若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步是否成功显示出杂交带第二步是否成功显示出杂交带第三步是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子杂交（DNA和DNA之间）目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞Ca2+处理（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译个体生物学水平的鉴定