9基因工程抗体和抗体工程

第五节抗体工程抗体研究进展3个阶段：①1890年白喉抗毒素，多克隆抗体；②1975年杂交瘤技术单克隆抗体；③1994年基因工程抗体；Cgenescodefortheconstantregionsofimmunoglobulinproteinchains.Vgeneissequencecodingforthemajorpartofthevariable(N-terminal)regionofanimmunoglobulinchain.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.4Heavyandlightchainscombinetogenerateanimmunoglobulinwithseveraldiscretedomains.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesTable24.1EachimmunoglobulinfamilyconsistsofaclusterofVgeneslinkedtoitsCgene(s).ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFamilyVGenesCGenesManMouseManMouseLambda300264Kappa300~100011Heavy~300100098Figure24.5ThelambdaCgenesegmentisprecededbyaJsegment,sothatV-Jrecombinationgeneratesafunctionallambdalight-chaingene.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.6ThekappaCgenesegmentisprecededbymultipleJsegmentsinthegermline.V-JjoiningmayrecognizeanyoneoftheJsegments,whichisthensplicedtotheCgenesegmentduringRNAprocessing.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.7Heavygenesareassembledbysequentialjoiningreactions.FirstaDsegmentisjoinedtoaJsegment;thenaVgenesegmentisjoinedtotheDsegment.ImmunoglobulingenesareassembledfromtheirpartsinlymphocytesFigure24.8ThelambdafamilyconsistsofVgenesegmentslinkedtoasmallnumberofJ-Cgenesegments.ThediversityofgermlineinformationFigure24.9ThehumanandmousekappafamiliesconsistofVgenesegmentslinkedto5JsegmentsconnectedtoasingleCgenesegment.ThediversityofgermlineinformationFigure24.10Asinglegeneclusterinmancontainsalltheinformationforheavy-chaingeneassembly.ThediversityofgermlineinformationFigure24.12Consensussequencesarepresentininvertedorientationateachpairofrecombiningsites.Onememberofeachpairhasaspacingof12bpbetweenitscomponents;theotherhas23bpspacing.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure24.13Breakageandreunionatconsensussequencesgeneratesimmunoglobulingenes.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.8Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.RecombinationbetweenVandCgenesegmentsgeneratesdeletionsandrearrangementsFigure15.9Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.一、噬菌体抗体库技术的基本方法⒈获取目的基因⒉抗体库技术的载体⒊淘筛⒋表达与鉴定它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与PⅢ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phagesurfacedisplaysystem)噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，该项技术的优点:将抗体的基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。二、噬菌体抗体库技术的特点⒈模拟天然全套抗体库⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术⒊可获得高亲和力的人源化抗体单克隆抗体噬菌体抗体杂交瘤技术展示技术宿主细胞:杂交瘤细菌筛选范围:~103107109时间:几个月几周操作:繁杂相对简单免疫:必须可避免人源抗体:+费用:高低生产量:有限无限基因获取:再克隆直接应用前景:有限不可估三、基因工程抗体表达⒈原核细胞表达⒉真核细胞表达⒊转基因植物表达⒋转基因动物表达第六节抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂⒈鉴定病原菌的抗体试剂⑴常用诊断血清的品种和用途①沙门氏菌属诊断血清②志贺氏菌属诊断血清③病原性大肠埃希氏菌诊断血清⑵诊断血清的制备步骤①制备细菌抗原②免疫动物和制备抗体血清⑶诊断血清诊断方法⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂⒊妊娠诊断试剂⒋抗ABO血型系统血清二、免疫标记技术用的抗体类试剂⒈荧光抗体诊断试剂⑴荧光抗体的制备⑵免疫荧光测定方法⒉免疫酶抗体诊断试剂⑴免疫酶染色法用抗体诊断试剂⑵酶免疫测定用抗体诊断试剂①HBsAg酶标诊断试剂②HBeAg酶标诊断试剂③HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂⒊放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。放射性核素标记抗体的方法：①氯胺-T法②Iodogen氏法抗原的测定有：①夹心法②间接法③竟争法3.竞争法Ag※Ag※Ab+AbAg(标本)(定量)AgAbEE终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物1.夹心法2.间接法①HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂②HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂③HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂④AFP放射性核素标记抗体诊断试剂⑤CEA放射性核素标记抗体诊断试剂常用标记抗体试剂有：三、导向诊断药物放射性核素标记抗体肿瘤放射免疫显像放射免疫显像优点：①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。③小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高N/NT值。④抗体在肿瘤部位可保留6～9日⑤能观擦抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。放射免疫显像定位技术将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DTPA是重金属离子络合剂，所以In-113M可以结合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在2小时内可完成。建立预定位技术需解决3个问题：①抗体在肿瘤组织滞留要7天以上。②Ab-DTPA偶联物比较稳定；③内源性金属离子对DTPA的封闭作用要小。第六节抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。二、抗癌药物偶联的抗体药物⒈常用的抗癌药物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。⒉抗体类药物逆转耐药性肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDR）。MDR是由基因调控的，其编码蛋白称为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由Mdr1基因编码，1280氨基酸残基，分子量170K。认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。三、毒素偶联的抗体药物⒈免疫毒素及其换代制品在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用