核酸类药物

第十四章核酸类药物第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产一、RNA与DNA的提取与制备（一）RNA的提取与制备1、工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素，制霉菌素等菌体。通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAMr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3~4h破坏酶)。浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／LHCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80％）。（二）DNA的提取与制备1．工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。2、具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸1、酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉产生5`-磷酸二脂酶红酵母产生3`-磷酸二脂酶2、酶解法制备戊糖核苷酸我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。4．菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。（二）发酵法生产核苷酸1．发酵法生产肌苷酸（IMP）2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸（三）半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。三、核苷的制备本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。（－）RNA化学水解法制备核苷1．核苷生产工艺流程RNA经甲酰胺化学水解制备核苷（－）RNA化学水解法制备核苷1．核苷生产工艺流程（图14·8）（二）发酵法生产核苷发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株；②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；③它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。1．发酵法生产肌苷(枯草杆菌)2、发酵法生产鸟苷和黄苷(肌苷产生菌)3、发酵法生产腺苷(产氨短杆菌)第二节核酸类药物核酸类药物可分两大类。一类为具有天然结构的核酸类物质，这些品种都是生物体合成的原料，或是蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代谢的辅酶。缺乏这类物质会使生物体代谢造成障碍，发生病态。提供这一类药物，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能。第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物质进行半合成为结构改造物，近年来发展为化学-酶合成法。大大提高收率，降低成本。一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮-2′-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。（二）生产工艺此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。②从鸟苷（300mmol／L）与胸腺嘧啶（300mmol／L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。二、阿糖腺苷Adeninearabinoside（一）结构与性质阿糖腺苷的化学名称为9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用StreptomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972年日本用Strepto－myceshebacecus4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷。1979年用从E．Coli中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。（二）生产工艺1、酶-化学合成法最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应，生成氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。2、以5`-AMP为原料的化学合成（三）作用与用途阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。三、三氮唑核苷（一）结构与性质三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174～176℃，易溶于水。这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。（二）生产工艺酶合成法使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosinearabinoside，ArabinosylCytosine，Aracytidine）（一）结构与性质阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。（二）生产工艺1．以5＇－CMP为原料的合成法（1）工艺路线：2、工艺过程：①水解：并加入处理好的6.5L氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90℃，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶液，离心分离，取上清液5至10μl，pH9.2电泳分析，检查水解程度。②氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm（pH2）③氨解：使氧桥断裂3‘，5’-乙酰基脱落。④成盐：2％盐酸-甲醇2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，PolycytidylicAcid，Poly1：C）（一）结构与性质1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85％氯化钠溶液。（二）生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：1、底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。3、PolyI：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转