15第三章-生化药物的生产-第三节--核酸类药物的生产

第三章天生化药物的生产第一节氨基酸类药物的生产第二节多肽和蛋白质类药物的生产第三节核酸类药物的生产第四节酶类药物的生产第五节糖类药物的生产第六节脂类药物的生产第七节维生素和辅酶类药物的生产核酸类药物的生产核酸知识复习核酸药物的分类核酸类药物的生产方法核酸类药物的生产实例核酸类药物的检测思考题核酸知识复习核糖（核糖脱氧核糖）核苷嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基核酸核苷酸嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。一、核酸药物的分类（一）具有天然结构的核酸类物质如：DNA、RNA、肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。获得：微生物发酵或从生物资源中提取生产。药理功能：有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理功能。著名企业：珍奥集团、GENTA公司（二）天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物如：三氟代胸苷、叠氮胸苷、拉米夫定（嘧啶类）、阿德福韦（嘌呤类）、恩替卡韦（第三代核苷类抗乙肝病毒药物）等。获得：由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。药理功能：治疗病毒病如乙肝、肿瘤、爱滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。二、核酸类药物的生产方法（一）核酸类药物的原材料除病毒外，所有的动植物组织中都含有核酸类物质，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同的组织中含量有所不同。动物胸腺中DNA含量较多，是提取DNA的原料；酵母细胞中RNA含量最多，是提取生产RNA的主要原料。（二）DNA和RNA的生产方法1、分离提取核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组织细胞中通过一定的方法获取总DNA或总RNA。如需进一步的纯化，常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳和密度梯度超离心。２、人工合成获取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化学的方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有核酸合成仪，但合成长度还有一定限制，并且该仪器价格昂贵。因此这种方法一般用于研究，不适合生产。（三）核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法1、酶解法生产酵母，从酵母中提取RNA，RNA经青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。2、半合成法微生物发酵与化学合成并用。3、直接发酵法采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。三、核酸类药物的生产实例（一）DNA的生产技术（二）RNA的生产（三）ATP制备（四）辅酶A的生产（一）DNA的生产技术1、提取原理在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物——核糖核蛋白（RNP）和脱氧核糖核蛋白（DNP），这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。RNA＋pro.→RNP（核糖核蛋白）DNA＋pro.→DNP（脱氧核糖核蛋白）0→0.14MNaCl溶液，DNP溶解度↓，RNP的溶解度↑；0.14M→0.5MNaCl溶液，DNP溶解度↑，RNP的溶解度↑。在制备DNA时，可利用0.14MNaCl溶液使DNP与RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶液（1～2M）尽量抽提DNP，然后再去除杂蛋白。2、工艺路线[抽提]猪脾脏组织浆液[预处理]沉淀1.71MNaCl，离心上清液（DNP，RNP）沉淀物（DNP）溶解液0.14MNaCl沉淀物白色纤维状DNA1.71MNaCl上清液（DNA）氯仿-异戊醇95%乙醇0.1MNaCl-0.5M柠檬酸混合液，离心[预处理][沉淀]冷冻，绞碎[溶解][去蛋白][沉淀][真空干燥]（二）RNA的生产1、来源微生物——酵母通常在细菌中RNA占5～25％，在啤酒酵母中占2.7～15％，在霉菌中占0.7~28%，面包酵母含RNA4.1～7.2％。酵母菌体提取优点：（1）收率高；（2）提取容易。２、RNA的提取——等电沉淀法3、工艺过程（1）预处理：压榨、除水；（2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来；（3）中和、除菌体；（4）分离：等电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来；（5）洗涤、干燥：95%乙醇酵母菌体提取液抽提清液RNA粗品RNA精品pH2-2.5[中和，分离][预处理、提取]压榨，稀NaOH[沉淀][洗涤、干燥]pH7，离心95%乙醇（三）ATP制备腺嘌呤前体腺苷AMPATP枯草杆菌160（Smr+Try－+Pur－）微生物或化学转化微生物枯草杆菌160（Smｒ+tyr－+pur－）菌株，在添加腺嘌呤（由丙二氰化学合成）的培养基上培养，可以大量累积腺苷。也可使用发酵法直接生产ATP，所用菌种是产氨短杆菌ATCC6872。（四）辅酶A的生产[除蛋白]新鲜猪肝[预处理]肝浆[提取]提取液滤液GAM树脂GAM-CoACoA浓集液LD-601-CoACoA粉HCl-NaClpH2-3CoA酸化液HClLD-601浓缩液[洗脱]上清液沉淀物丙酮绞碎水，煮沸15minTCA，4h[吸附][梯度洗脱][酸化][吸附]HNO3[酸化][沉淀][脱水干燥]四、核酸类药物的检测1、DNA含量测定DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。（1）定磷法磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在660nm。（2）定糖法——二苯胺法酸性条件下，DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合物，吸收峰595nm。2、RNA含量测定（1）定磷法——660nm；（2）定糖法——地衣二酚（苔黑酚）法。盐酸水解RNA，使核糖游离出来，并生成糠醛，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在670nm处有最大吸收峰。3、核苷酸、核苷含量的测定——紫外分光光度法它们都有特殊的紫外吸收曲线，选取合适的波长，可以根据其吸收值测定核苷、核苷酸的含量。思考题1.核酸类药物的种类和药理功能是什么？2.DNA、RNA及HS-CoA的生产方法。3.如何检测核酸类药物？核苷酸组分NNNHNNH2NNHNH2ONHNNHNONH2OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶NHNHOO尿嘧啶NHNHOO胸腺嘧啶珍奥核酸DNA药物核苷类药物恩替卡韦胸腺酵母ABI3948核酸合成纯化仪可自动完成DNA的合成，切割，脱保护，OPC纯化和定量等过程。在三个模块中同时进行合成、切割脱保护和纯化收集，24小时内可完成48个寡核苷酸片段的合成和纯化。密度梯度离心机