14第三章-生化药物的生产-第二节-多肽和蛋白质类药物的生产

第三章天生化药物的生产第一节氨基酸类药物的生产第二节多肽和蛋白质类药物的生产第三节核酸类药物的生产第四节酶类药物的生产第五节糖类药物的生产第六节脂类药物的生产第七节维生素和辅酶类药物的生产第三节多肽和蛋白质类药物的生产一、典型多肽和蛋白质类药物的生产实例二、多肽和蛋白质含量测定一、典型多肽和蛋白质类药物的生产实例（一）提取法生产胸腺素（二）提取法生产胰岛素（一）提取法生产胸腺素1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），并可提供临床使用。胸腺素具有增强细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。用于治疗细胞免疫缺损性疾病，如胸腺发育不全、重症混合性免疫缺乏症、运动失调性毛细血管扩张症、麻风、重症感染、复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、恶性肿瘤和抗衰老。促进T淋巴细胞分化成熟。（1）临床上主要用于治疗细胞免疫缺陷疾病，如胸腺发育不良、重症联合性免疫缺陷症、多次感染综合症等；（2）肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应答增强，从而加强化疗和放疗的抗肿瘤效果。（3）用于治疗急性红斑狼疮。1、药理作用与临床作用胸腺素是几十种多肽组成的混合物，相对分子量在1万以下；等电点在3.5～9.5；为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域：α区：3.5～5.0三个区域β区：5.0～7.0γ区：7.0～9.5胸腺素对热稳定，短时间内加热至80℃，其生物活性不降低。2、胸腺素的结构与性质3、生产工艺路线小牛胸腺[预处理]去脂肪和结缔组织，绞碎胸腺碎块[盐析]0.9%NaCl-0.5%辛醇提取液[过滤]纱布过滤上清液(F1)上清液(F2)[除杂蛋白]80℃,15min,冷却上清液(F3)25%硫酸铵沉淀(F4)[盐析]50%硫酸铵上清液[除杂]溶解，离心洗脱液[提取]SephadexG-150[色谱分离]洗脱液G-25[脱盐]胸腺素(F5)[干燥]冷冻干燥4、工艺过程(1)预处理：去脂肪，绞碎(2)提取：生理盐水（盐水溶液），匀浆，离心（组分1）(3)除杂蛋白：加热，60℃，离心（组分2）(4)纯化：a.分段盐析pH=7.0磷酸盐缓冲液，硫酸铵饱和度0.25，上清液（组分3）调pH=4.0，硫酸铵饱和度0.5，盐析物（组分4）b.除杂0.1MTris-HCl缓冲液（pH=8.4）溶解，4000×离心30minc.色谱分离凝胶层析SephadexG-150柱，第3个峰（葡聚糖凝胶，分离范围5,000～300,000）d.脱盐凝胶层析SephadexG-25柱，第1个峰（分离范围1000～5000）(5)干燥：冷冻干燥（组分5）5、工艺讨论（1）除加热步骤外，所有步骤应在0～4℃下进行。（2）组分4过SephadexG-150柱时，在276nm波长检测共有4个吸收峰，胸腺素活性位于第3个峰。进一步SephadexG-25柱脱盐，共有2个吸收峰，胸腺素活性位于第1个峰。（二）提取法生产胰岛素1、功能和来源（1）功能调节血糖浓度，治疗胰岛素依赖性糖尿病(Ⅰ型)。1965年，我国完成了世界上第一个人工合成蛋白质——牛结晶胰岛素的全合成工作。（2）来源胰脏中胰岛β细胞（胰岛中包括α细胞、β细胞、γ细胞）分泌的一种蛋白质激素。1965年9月17日，我国在世界上第一次人工合成了一种具有生物活性的结晶蛋白质——胰岛素，从而表明我国在多肽和蛋白质合成方面的科学技术已在世界上居先进地位。这种胰岛素是经过几年的艰苦努力，由中科院生化所、有机化学所和北大化学系合作，在王应睐和汪猷领导下合成成功的。（1）结构由A链、B链通过2个二硫键连接而成。（2）性质①白色或类白色结晶粉末。②相对分子量：牛5733，猪5764，人5784。③胰岛素在pH=4.5～6.5范围内几乎不溶于水。④在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。2、结构与性质胰岛素的分子模型3、生产工艺路线冻胰[预处理]胰片[浓缩]乙酸,草酸提取液[碱化]氨水pH8～8.4碱化液酸化液[酸化]硫酸pH3.6～3.8浓缩液减压蒸发去脂溶液[去脂]速热速冷盐析物[盐析]NaCl,pH2～2.5滤液[提取]水、丙酮,氨水pH4.2～4.3[酸化]沉淀氨水,乙酸锌,pH6[锌沉淀]胰岛素精品[碱化][结晶]柠檬酸、乙酸锌、丙酮，氨水,pH8,过滤调pH6结晶[洗涤][干燥]水,丙酮、乙醚；真空干燥刨碎4、工艺过程方法：酸醇法和锌沉淀法（1）提取：酸醇法（2）碱化、酸化：除碱性蛋白、酸性蛋白（3）浓缩：30℃以下，减压浓缩（4）去脂、盐析：去除脂类、分开杂蛋白（5）酸化、锌沉淀：除酸性蛋白（6）碱化、锌沉淀：除碱性蛋白（7）洗涤、干燥：胰岛素成品二、多肽和蛋白质质量鉴定（一）多肽和蛋白质含量测定1、凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003）蛋白质是含氮的有机化合物，与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数（6.25），即为蛋白质含量。1.安全管2.导管3.汽水分离管4.样品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶2、紫外分光光度法即利用蛋白质在280nm处的的吸收峰，以标准蛋白质为参考，检测其中的蛋白质含量。3、福林-酚试剂法（Lowry法）蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。４、考马斯亮兰法（Bradford法）1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。1、电泳均一性测定在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。（二）纯度的鉴定电泳2、超速离心（ultracentrifugation）在超速离心机中，应用强大的离心力分离、制备、分析物质的方法。超速离心机的离心速度为每分钟60000转或更多，离心力约为重力加速度的500000倍，可分成制备性超速离心机和分析性超速离心机两大类。两者均装有冷冻和真空系统。制备性超速离心机容量较大，主要用于分离制备线粒体、溶酶体和病毒等以及具有生物活性的核酸、酶等生物大分子。分析性超速离心机另装有光学系统，可以监测旋离过程中物质的沉降行为并能拍摄成照片。Beckman低温超速离心机3、可结晶性物质从液态（溶液或溶融状态）或气态形成晶体的过程叫做结晶。结晶操作不仅能够从溶液中取得固体溶质，而且能够实现溶质与杂质的分离，借以提高产品的纯度；同时也是纯度的检验方法，因为只有相对较纯的蛋白溶液才能形成结晶。4、蛋白质功能及免疫抗原性测定检测蛋白质的生物学活性，由此判定该蛋白的纯度。通过检查抗原抗体反应也可以判定蛋白质的纯度，因为蛋白是典型抗原，不同蛋白质的抗原反应不同。思考题1.简述生产胸腺素的生产工艺路线。2.简述生产胰岛素的生产工艺路线。3.蛋白质产品含量和纯度的检测方法。