第三章.核酸

第三章核酸化学第一节概述第二节核酸的组成第三节核酸的结构第四节核酸及核苷酸的性质第五节核酸的分离纯化第一节概述一、核酸的发现与发展1869年瑞士人Mischell从细胞核中分离出核素。1871年Ottoman分离出类似物质，命名为核酸。1944年Avery进行了肺炎球菌转化实验，揭示了核酸的生物功能。肺炎球菌转化试验1950年前后，前苏联科学家Chargaff等人研究发现了碱基互补配对原则，即构成DNA的四种碱基在数量上A=T，C=G。同一时期，Wilkins对DNA分子进行了X-射线衍射研究，得到衍射图谱。1953，Watson-Crick提出了DNA的双螺旋模型。二、核酸的类别、分布和功能核酸的类别∶DNA∶主要集中在细胞核内RNA∶主要分布在细胞质中，分为三种rRNA(核糖体RNA)占80%以上；mRNA(信使RNA)占5%；tRNA(转运RNA)占15%。三、应用与生产在食品方面∶强力助鲜剂，如肌苷酸和鸟苷酸。在医药方面∶ATP、CoA等。第二节核酸的组成一、核酸的元素组成由C、H、O、N、P五种元素组成。P是特征性元素，含量相对恒定：RNA含磷9.0％；DNA含磷9.2％。定磷法测定核酸含量的原理是先用强酸将有机磷转化成无机磷酸，再与定磷试剂反应可测出含P量，进一步算出核酸含量。二、核酸的完全水解产物核酸的水解：核酸聚核苷酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基核酸的基本组成单位∶戊糖、磷酸、含氮碱基。其中碱基包括∶嘌呤(腺嘌呤A、鸟嘌呤G)嘧啶(胞嘧啶C、尿嘧啶U、胸腺嘧啶T)磷酸OHHO-P=OOH戊糖∶核糖和脱氧核糖(见图)碱基∶(见图)1、嘌呤A（腺嘌呤）G（鸟嘌呤)2、嘧啶C(胞嘧啶）U（尿嘧啶）T（胸腺嘧啶)HHHHHHHHH334455555551111122222333334444466666778899三、核苷与核苷酸嘌呤核苷是嘌呤的第9位N与核糖或脱氧核糖第1´位碳连接。嘧啶核苷是嘧啶的的第1位N与核糖或脱氧核糖第1´位碳连接。NNNNNH2OHOHHHHHHONHNNONH2NOHOHHHHHHO脱氧腺苷脱氧鸟苷991´1´OHOHHHHHHONNHOOH3COHOHHHHHHONNNH2O脱氧胞苷脱氧胸苷1´1´11NHOONOOHOHHHHHHONNNNNH2OOHOHHHHHHONHNNONH2NOOHOHHHHHHONNH2ONOOHOHHHHHHO四种核苷腺苷鸟苷胞苷尿苷核苷酸是核苷的磷酸酯。核糖核苷酸的磷酸酯有三种形式(2´、3´和5´位)；脱氧核糖核苷酸的磷酸酯有两种形式（3´和5´位)。构成RNA∶AMP、GMP、CMP、UMP构成DNA∶dAMP、dGMP、dCMP、dTMP（不注明磷酸基团位置时都是指5´核苷酸）NNNNNH2OHOHHHHHOP-OO-ONNNNNH2OHOHHHHPOO-HOO-5´-dAMP3´-dAMPNNNNNH2OOHOHHHHPOO-HOO-NNNNNH2OOHOHHHHHOP-OO-O5´-AMP3´-AMP四、稀有组分稀有组分是稀有碱基和稀有核苷的总称。1、稀有碱基∶次黄嘌呤(I)、黄嘌呤(X)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、二氢尿嘧啶(D)、5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)2、稀有核苷∶(见图)假尿嘧啶核苷(Ψ)、次黄嘌呤核苷、二氢尿嘧啶核苷五、重要的核苷酸衍生物凡是具有含氮杂环-糖醇-磷酸结构的都称为核苷酸的衍生物。1、多磷酸核苷酸指体内核苷酸可进一步在原位磷酸化而生成多磷酸核苷酸如：ATPGDPCDPUDPGTPCTPUTPdATP……等等。其中ATP最常见，称为高能化合物——能量传递中心（包含两个高能磷酸键）～～2、环化核苷酸一个磷酸与同一戊糖分子形成两个酯键最常见：3´，5´-环腺苷酸cAMP3´，5´-环鸟苷酸cGMP结构见图功能：生物体内的基本调节物质，起第二信使的作用。cAMP的结构第三节核酸的结构I、DNA的结构一、DNA的一级结构核酸的一级结构是指单核苷酸之间的连接方式及核酸分子中的核苷酸排列顺序。DNA、RNA都是由许多核苷酸通过3´、5´－磷酸二酯键将前一个核苷酸与后一个核苷酸连接起来，形成无分支的多核苷酸链。核酸分子的多核苷酸链有两个末端：在链的一端的一个戊糖的3´位上OH是游离存在的，另一端的戊糖其5´位上连有一个磷酸基团呈单磷酸酯状态，这两个末端分别称为3´-末端及5´-末端。多核苷酸链的表达方式∶(见图)二、DNA的二级结构即DNA双螺旋结构模型(见图)DNA双螺旋结构模型的要点∶(1)DNA分子是由两条反平行的多聚脱氧核苷酸链，绕同一中心轴盘旋形成的右手螺旋结构；(2)每条主链由脱氧核糖与磷酸通过3´、5´-磷酸二酯键连接而成，并位于螺旋外侧。碱基位于螺旋内侧，碱基平面与螺旋中心轴垂直。螺旋表面有两条螺旋形的凹槽∶大沟和小沟。34(3)双螺旋的直径是2nm，沿中心轴，每一个螺旋周期有10个核苷酸对，螺距是3.4nm，碱基对之间的距离（碱基堆积距离）为0.34nm。(4)两链间的碱基以氢键互相配对。A与T配有两个氢键，G与C配有三个氢键。DNA分子所含嘌呤碱基的总数等于嘧啶碱基的总数(即A+G=T+C)。(见图)⑸稳定DNA双螺旋的主要作用力①碱基堆积力（相邻碱基对平面间的疏水相互作用，是维持双螺旋结构的主要力量）②互补碱基间的氢键③DNA磷酸基与溶液中阳离子形成离子键④原核生物：DNA与精胺、亚精胺结合真核生物：DNA与组蛋白结合DNA双螺旋的种类DNA双螺旋结构模型阐述的是常见的B型DNA(右旋DNA)，除此之外还存在A型DNA和Z型DNA(左旋DNA)。三、DNA的三级结构DNA的三级结构是指双螺旋DNA的扭曲或再螺旋。如∶开环形----由直链双螺旋DNA分子两端连接而成，其中一条链留有一个小缺口。闭环超螺旋形----是双链环形DNA扭曲成麻花状。发夹形----DNA变性后在反相重复序列时，可形成发夹形。四、染色体的结构染色体是由一个DNA分子和许多不同种类的蛋白质结合而成的复合物，其中蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。很长的DNA分子经过好几个层次的折叠压缩，被包裹在染色体中。染色体的结构示意图如果人体有1014个细胞,每个细胞DNA含量为6.4×109bp,试计算人体DNA(以双螺旋形式存在)的总长度为多少米?3.4×10-10×6.4×109×1014=2.2×1014mⅡ、RNA的结构一、RNA的一级结构(以mRNA为例)RNA分子的基本结构是一条线性的多核苷酸链，由四种核糖核苷酸以3'，5'-磷酸二酯键连接而成。1、原核mRNA的一级结构原核mRNA一般为多顺反子。在5'末端和3'末端无特殊结构。在mRNA分子内部，每一个编码区从起始密码(AUG)开始，到终止密码为止。各个编码区之间、5'端的第一个编码区之前以及3'端的最后一个编码区之后，都有一段非编码区。顺反子∶是指mRNA上对应于DNA上一个完整基因的一段核苷酸序列。2、真核mRNA的一级结构真核的mRNA一般为单顺反子，即一条mRNA链只翻译产生一条多肽链。其结构模式为∶5’-帽子-5’非编码区-编码区-3’非编码区-多聚A与原核生物相比较，多了5’-帽子结构和3’-polyA尾巴。5’-帽子结构为：3’-m7G-5’ppp5’-Nm-3’-p帽子结构可防止5'-核酸外切酶的降解，并与蛋白质合成的正确起始有关。多聚腺苷酸尾(polyA尾)并不是从DNA上转录下来，而是由polyA聚合酶催化添加的。其作用是延长mRNA的半寿期，从而可以增加蛋白质合成的数量。此外，还有助于mRNA穿过核膜，进入细胞质执行其模板功能。二、RNA的二级结构RNA的二级结构是指单链RNA分子自身回折，链内的互补碱基配对，形成局部双螺旋区，未配对的部分则形成突环相间分布成花形结构。1、tRNA的二级结构tRNA的二级结构呈三叶草形。(见图)包括以下结构单元：（1）AA接受臂末端为CCA，接受活化AA（2）二氢尿嘧啶环（D环）（3）二氢尿嘧啶臂（D臂）（4）反密码环中间三个核苷酸称为反密码子（5）反密码臂（6）TψC环是核糖体识别部位（7）TψC臂（8）额外环（可变环）tRNA分类的重要指标2、rRNA的二级结构rRNA的单链也自身回折，链内的互补碱基配对，形成局部双螺旋区，形成特定的二级结构。(见图)三、RNA的三级结构RNA在二级结构基础上进一步回折扭曲，使分子内部的自由能达到最小，在二级结构中突环上未配对的碱基由于RNA链的再度扭曲与另一突环上的未配对碱基相遇，形成新的氢键配对关系，其结果是平面花形结构变成立体花形结构。tRNA三级结构呈倒L型。tRNA的三级结构tRNA结构第四节核酸及核苷酸的性质一、一般物理性质DNA的相对分子量很大(106-109)，白色絮状；RNA的相对分子量较小(1-10万)，白色粉末或结晶状。均为极性化合物，易溶于水，难溶于有机溶剂。二、紫外吸收性质嘌呤碱和嘧啶碱均含有共轭双键结构，因此，碱基、核苷、核苷酸、DNA和RNA在240nm～290nm范围内均有紫外吸收。最大吸收峰在258nm～260nm。0481216180220260300波长(nm)克分子吸收胞嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶尿嘧啶嘌呤、嘧啶在pH7时的吸收曲线核酸类物质可利用公式：A=KCL定量分析。K为（比）消光系数，代表一定浓度溶液的消光值。K换成ε—称摩尔消光系数。ε主要应用在核苷酸的定性定量上。核酸上应用时将ε用ε(p)代替，它表示摩尔磷消光系数，指含磷为1摩尔的核酸溶液在260nm处的消光值。在260nm波长天然RNA的ε(p)在7000～10000之间；而DNA的ε(p)在6000～8000之间。有公式：A=ε(p)cL(c=W/30.98)ε(p)=30.98×A/W.LW=30.98×A/ε(p).L未知核酸的近似浓度=W×11核酸的紫外吸收性质可以用于鉴定DNA和RNA的纯度，常用A260/A280比值来判断。纯DNA∶A260/A280=1.8纯RNA∶A260/A280=2.0若样品含有蛋白质杂质，A260/A280比值下降。核酸变性或复性时，紫外吸收性质发生变化。增色效应∶当核酸变性或降解时，其紫外吸收显著增强，这就是核酸的增色效应。减色效应∶当变性的核酸在一定条件下恢复其原有的性质时，紫外吸收的强度又可恢复到原有的水平，这种现象称为减色效应。三、核酸和核苷酸的两性解离在核酸和核苷酸分子中，既含有可以给出H+的磷酸基团，又含有可以得到H+的碱性基团(碱基上的－N=，如嘌呤的N1和N7，胞嘧啶的N3)，所以核酸和核苷酸是两性化合物，有等电点。核苷酸的解离常数pKa碱基=NH+烯醇式羟基磷酸基一级磷酸基二级AMP（N1)3.700.896.01GMP(N7)2.309.330.705.92CMP(N3)4.240.805.97UMP9.431.025.88TMP10.01.66.500501000123456789pH离子化程度%AMP碱基第—磷酸基第二磷酸基0501000123456789GMP烯醇式羟基第—磷酸基碱基第二磷酸基0501000123456789CMP第—磷酸基第二磷酸基碱基0501000123456789UMP第—磷酸基第二磷酸基烯醇式羟基核苷酸的解离曲线从核苷酸的解离曲线可以看出，在第一磷酸基和碱基解离曲线的交点处，带负电荷的磷酸基正好与带正电荷的碱基数目相等，这时的pH值即为此核苷酸的等电点pI。各种核苷酸的等电点并不相同。尿嘧啶酸的碱基碱性很弱，实际上测不出其碱基的解离曲线，故不能形成两性离子。pH3.5:净负电荷AMP-0.46GMP-0.95CMP-0.16UMP-1TMP-1电泳速度四、核酸的变性、复性和分子杂交1、变性（1）概念核酸变性是指核酸分子中双螺旋区域的碱基对之间的氢键受某些理化因素的作用而破坏，变成单链的过程。核酸变性不涉及共价键的断裂，所以变性后相对分子量不变，但其理化性质和生物功能都会发生变化，表现为∶（1）溶液粘度降低；（2）沉降速率增加；（3）紫外吸收显著增强（增色效应）DNA可增加20