生殖医学与遗传咨询

生殖医学与遗传咨询江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院生殖医学国家重点实验室刘嘉茵不良生殖结局(AdverseReproductiveOutcomes)不良生殖结局的致病因素不良生殖结局的母体相关危险因素出生缺陷和生殖障碍问题面临的挑战多个致病或易感基因和环境交互作用导致的结构和功能的异常发生机制复杂，人种间有差异常规的分子生物学手段无法检测和筛查研究单一、分散而缺乏系统，基础和临床研究脱节对缺陷儿缺少进一步的随访和康复体系出生缺陷防控和干预：知识瓶颈，技术瓶颈，体制瓶颈生殖障碍的遗传学研究领域男性和女性的生殖健康筛查配子生成和发育异常性腺发育和激素男女性不孕不育症排卵障碍（PCOS和POI）盆腔子宫内膜异位症卵巢反应预测卵巢刺激的个体化方案遗传疾病的植入前诊断和筛查复发性流产UmbilicalveinpunctureAmniocentesisChorionvillussampling人类生殖过程的遗传学检测阶段概要胚胎植入前诊断PGDPGD的基本原理适应症用于染色体疾病PGD的基本技术和现代技术PGD的取材单基因PGD技术的临床应用胚胎植入前遗传学筛查PGS男科不育的遗传学临床咨询复发性流产的遗传学检测现代遗传学技术在生殖医学领域的成果胚胎植入前遗传学诊断/筛查Pre-implantationGeneticDiagnosis/Screening(PGD/PGS)对有遗传性缺陷高风险的夫妇，通过体外受精（InVitroFertilization,IVF）程序，应用分子、细胞遗传学技术在体外选择正常胚胎植入，亦称为孕前诊断。胚胎植入前遗传学诊断卵裂求活检进行遗传学检测12345异常胚胎异常胚胎异常胚胎移植信号正常的胚胎PGD的适应症染色体异常：平衡易位，罗氏易位等单基因疾病：常显、常隐、X连锁易感基因的剔除：乳腺癌等HLA配型染色体平衡易位PGD/FISH探针选择Metaphasechromosomesblastomerenormal11normal22der11der22t(11;22)(q25;q12)Metaphasechromosomesblastomerenormal13normal14der13-14rob(13;14)(q10;q10)染色体平衡易位FISH/PGD46,XY,t(1;12)本中心FISH/PGD染色体异常种类性染色体数目异常（47,XXY;47,XXX;47,XYY)；罗伯逊易位（45,XY,r(13,14);45,XY,r(12,14)）；染色体平衡易位（46,XY,t(1,12);46,XX,t(12,14));染色体臂间倒位（46,XY,inv(9);46,XY,inv(6))；Y染色体DAZ基因缺失；染色体非整倍体(47,XY,+21）;X-连锁遗传性疾病染色体微阵列芯片的临床应用染色体微阵列芯片（CMAs）于2007年和2011年已经在指南里出现，并认为在发育迟缓、自闭症、和多发性畸形的诊断中可以替代染色体核型分析在人类生殖领域，CMAs2004年开始用于流产绒毛染色体分析，和2005年胎儿畸形诊断，并于2010年取代了FISH用于PGS。2009年开始CMAs被推荐在妊娠期可疑胎儿畸形但染色体核型正常，或染色体核型无法获得时，作为联合诊断的工具应用。目标CMAs被推荐用于与临床有关联，或不确定关联的非重叠CVN区域的检测。样本预处理简单全面分析染色体组分辨率高统一方法结果伴读自动化，客观ArrayCGH技术在PGD中优势Chr.11Chr.546，XY，t(5;11)(q35;q11)ArrayCGH的PGD应用实例5q35.1-qterdel9.7M11q12.2-qterdup74.5MArrayCGH的PGD应用实例46，XY，t(5;11)(q35;q11)46,XX,t(7;10)(p22;q22)Chr.10Chr.7ArrayCGH的PGD应用实例7p21.2-pterdup15M10q21.2-qterdel70.9MArrayCGH的PGD应用实例46,XX,t(7;10)(p22;q22)ArrayCGH-PGD的临床结局项目相互平衡易位罗氏易位总计取卵周期数583290女方平均年龄（岁）29.6±3.929.7±4.029.7±3.9活检胚胎数（枚）352176528平均活检胚胎数（枚/取卵周期）6.15.55.9明确诊断胚胎数（%）98.3%（346/352）97.7%（172/176）98.1%（518/528）染色体正常胚胎数（%）20.2%（70/346）30.8%（53/172）23.7%（123/518）无可移植性胚胎周期数（%）27.6%（16/58）28.1%（9/32）27.8%（25/90）平均移植胚胎数（枚/移植周期）1.01.01.0移植周期数512879新鲜移植周期数31233冻胚移植周期数202646临床持续妊娠数（%）41.2%（21/51）57.1%（16/28）46.8%（37/79）新鲜周期持续妊娠数（%）38.7%（12/31）0（0）36.4%（12/33）冷冻周期持续妊娠数（%）45.0%（9/20）61.5%（16/26）54.3%（25/46）注：数据来源于本中心2011年7月—2013年11月，活检胚胎≥4枚病例总结新一代测序技术（NGS）临床应用2GNGS技术已经用于单细胞的染色体组和单基因的检测。3GNGS技术满足：更少的模板DNA，更长的测序片段，更好的精确度，更快的运行时间，更低的成本，更保真的全景Array–CGH和二代测序核型分析比对示例karyotype：XXchr19{q13.33-q13.43(9.19Mb)}chr7{q31.32-q36.3(35.91Mb)}-chr20{p13-p12.3(6.98Mb)}↓↓↓↓南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014二代测序用于染色体PGD用二代测序技术和SNParray比较了16对夫妇38枚和14对染色体异常夫妇的29枚囊胚滋养层活检细胞核型。测序方法对平衡易位的检出精确度更高，但是需要时间和胚胎冷冻。MPS数字图像SNParrayYinXYetal，BIOLOGYOFREPRODUCTION，2013样品例数/编号样品类型芯片结果（sureplex扩增）测序结果（sureplex扩增）比对结果18例BLASTOMEREBalanced,EuploidBalanced,Euploidcoincide1BLASTOMEREBalanced,Euploid+(Xq26.3-q27.3)inconsistent1BLASTOMERE-(6p25.2-pter);+(18q12.3-qter)+(18q12.3-q23)inconsistent8TEBalanced,EuploidBalanced,Euploidcoincide1TE+(7q31.31-qter),+(19q13.33-qter);-(20p12.3-pter)+(7q31.31-qter),+(19q13.33-qter);-(20p12.3-pter)coincide1TEBalanced,Euploid+(1p21.1-p21.1)inconsistent30BM/TE二代测序的单卵裂球和滋养细胞的实验结果南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014样品编号芯片结果（MDA扩增）测序结果（MDA扩增）比对结果S146，XX46，XXcoincideS246，XX46，XXcoincideS346，XX46，XXcoincideS446，XY46，XYcoincideS546，XY46，XYcoincideS646，XY46，XYcoincideS746,XY,-12(pter-q13.11),+20(pter-q11.22)46,XY,-12(pter-q13.12),+20(pter-q11.23)coincideS847,XY,+8(q13.3-qter),+1346,XY,-5(q35.1-qter),+8(q13.1-qter),+13coincideS946,XY,+15(q11-q13.1),-22(q11.1-q11.21)46,XY,+15(q11.1-q15.1),-22(q11.1-q12.3)coincide实验囊胚样品芯片和测序结果比对南京医科大学第一附属医院生殖中心，2014二代测序无创产前诊断技术无创产前（NIPD）诊断技术已广泛应用母亲外周血游离胎儿DNA(cffDNA)进行非整倍体的筛查（6%）。2010首次提出二代测序技术用于胎儿DNA全基因组检测。2012年Chenetal的方法能够富集100%胎儿等位基因，一步获得胎儿全基因组和倍体，并且进一步分析得到重组位点信息。这一技术进步可以对诊断胎儿孟德尔遗传疾病、筛查复杂性疾病、鉴别新发的拷贝数异常、包括微缺失和微重复的异常，有重大的推动。FanHC,etal.Nature2012,487:320-324.ChenS,etal.GenomeMedicine,2013.PGD/PGS的活检的材料极体活检卵裂期活检囊胚期活检活检取材的样本能否代表胚胎的遗传物质？活检取样操作本身对胚胎发育潜能的影响？SNP单体型分析--ScottRT,etal.FertilSteril,2013序贯活检（PB1、PB2、卵裂球、囊胚活检）用PB1、PB2进行PGD的原理两次减数分裂的类型姐妹染色单体过早分离（PrematureSeparationofSisterChromatids，PSSC）分裂后期迟滞，丢失一条染色体，恢复二体性；单体细胞通过染色体自我复制，恢复二体性。SNParray囊胚活检筛查UPD约0.06%，结果不支持非整倍体的自我修复机制。AngellRR.HumGenet,1991PellestorFetal.HumGenet,2003GabrielAS,etal.JMedGenet,2011MagliMC,etal.RBMonline,2012GueyeNA,etal.FertilSteril,2013滋养外胚层细胞是否代表内细胞团？假说：异常细胞倾向于向滋养外胚层迁移TE和ICM染色体组检测比较方法：51个优质囊胚，分离为ICM和TE，部分囊胚的TE被分离TE1和TE2。SNParray分析染色体非整倍性。结果:41个整倍体胚胎的TE和ICM结果一致;10个非整倍体胚胎中2个（3.9%）TE和ICM结果不同，提示嵌合体。结论：TE活检可以反映内细胞团（ICM）的染色体组成EmbryoICMTE292958222222515180---JohnsonDS，etal.MHR，2010卵裂期和囊胚期活检对临床结局的影响配对随机研究35岁女性，正常的卵巢储备（day3FSH12U/L，基础窦前卵泡≥12）；男方精液100,000运动型精子，≥1%的正常形态精子卵裂期活检组(n=46)囊胚活检组(n=70)SNParray:进行SNP分型示踪提示：卵裂期活检，胚胎种植率相对降低39%，而囊胚活检无明显影响。ScottRT,etal.FertilSteril,2013单卵裂球单卵裂球囊胚活检单卵裂球和滋养细胞活检的信号质量比较染色体平衡易位囊胚活检PGD临床结局临床指标结果囊胚活检周期数69活检囊胚数305平均活检囊胚数/周期3.5无正常信号周期16（23.1%）完成冻胚移植周期24平均移植胚胎数/周期1.0临床妊娠周期数17/24(70.8%)胚胎种植率17/24(70.8%)南京医科大学第一附属医院生殖中心2013.12~2014.7单基因疾病PGD的适应症有明确的单基因疾病的家族史；原先有明确的单基因疾病的患儿；需HLA配型；有肿瘤相关基因突变家族史；部分单基因PGD诊断的遗传性疾病丙种球蛋白缺乏耳聋(GJB2Connexin26)a－地中海贫