辅助生殖PGD与PGS技术

植入前遗传学诊断及筛查技术临床应用谭跃球[e-mail],13574193096中南大学生殖与干细胞工程研究所*人类干细胞国家工程研究中心*中信湘雅生殖与遗传专科医院内容概要植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD检测流程染色体易位携带者的PGD基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)单基因病PGD背景介绍适应征及技术进展临床应用植入前诊断植入前遗传学诊断和筛查的概念植入前遗传学诊断的临床应用植入前遗传学筛查的临床应用一、植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD(PreimplantationGeneticDiagnosis)：又称为孕前诊断(preconceptiongeneticdiagnosis,PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选择正常的胚胎植入。第一部分植入前遗传学诊断和筛查的概念第三代试管婴儿？PGD/PGS是以ICSI-ET为基础，结合显微操作技术和分子生物学研究的而发展起来的。PGD的意义PGD可在孕前阶段杜绝X-连锁隐性遗传病、染色体病和基因病患儿的妊娠，避免人工流产终止异常妊娠给广大妇女的身心痛苦。理论上还可减少遗传病在人群中的遗传负荷。PGD是遗传性病防治的重要手段，是Edwards获诺贝尔奖的理由之一。植入前诊断传统的产前诊断PGD发展历程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在显微操纵下对兔囊胚进行活检，取出少量滋养外胚层细胞分析染色质来选择雌性胚胎。1990年Handyside报道了世界第一例植入前性别诊断婴儿的出生，开创了产前诊断的新纪元。1994年，Munne用FISH技术，在植入前诊断胚胎染色体非整倍体及性别获得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和单链多态性分析技术，对单细胞进行视网膜母细胞瘤的易感性分析，在植入前确定胚胎未来发生肿瘤的可能性大小，从而为PGD应用于人类胚胎基因表达的研究开辟了崭新的途径。2001年Verlinsky有报道对胚胎进行HLA选型以便于骨髓移植。进一步拓宽了该技术的研究和应用。染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等）染色体异常的筛查单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因异常的筛查PGD期望解决的问题植入前遗传学筛查的概念胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGeneticScreening,PGS），是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。PGS目前特指针对染色体数目异常，即非整倍体；PGS理论上将来可以应用于单基因病。PGS是低风险人群，夫妻双方的染色体或者基因是正常的。二、PGD检测流程卵子精子ICSI活检取样胚胎冷冻遗传学检测选择胚胎胚胎植入遗传咨询知情谈话FISHCHIPPCRMPSIVF临床促排卵极体活检•活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常或基因突变，以及减数分裂异常造成的染色体非整倍体。•优点：对卵母细胞的发育没有影响。缺点：只能检测母源性的染色体异常；不能检测受精后发生的染色体异常；可检测细胞数少，易发生检测失败。（一）活检技术选择卵裂球活检•在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球，进行遗传学诊断。•优点：最成熟最常用的活检方法。缺点：活检出卵裂球后降低了胚胎的发育潜能；细胞数少，容易发生检测失败(细胞固定及杂交失败，扩增失败，ADO等)。囊胚活检•D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进行遗传学检测。•优点：对滋养层细胞的活检不影响将要发育成胎儿的内细胞团的发育；可检测细胞数较多，检测失败概率降低。对SNP-array而言，能大大减低费用。缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果）需将活检后的囊胚冷冻保存。•染色体易位(Translocation):一种染色体结构异常，一条染色体的一段转移到同一条或另一条染色体上，导致易位片段基因的重排(Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010)•易位是一种常见的染色体结构重排异常，新生儿中发病率0.2%.(Sternetal.,1999)•临床上两种类型的易位最常见：罗氏易位和相互易位一、染色体易位携带者的FISH-PGD第二部分植入前遗传学诊断的临床应用4q2520q12相互易位：两条非同源染色体之间进行片段的交换，常常是整个末端的断裂并互换。--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010着丝粒→←着丝粒Derivativechromosome4Derivativechromosome20罗氏易位：这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体(D组andG组,染色体13-15,21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010Centromere→Centromere→Chr21Chr14der(14;21)易位携带者的健康风险•平衡的染色体易位个体往往没有明显的疾病表型，称为“易位携带者”。但却多存在生殖的障碍；•易位携带者主要的遗传风险起源于配子减数分裂的过程，携带者可产生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以导致流产，出生染色体异常患儿引起出生缺陷（特别是智力障碍），并可导致不孕和不育；平衡易位携带者的遗传风险四射体对于相互易位携带者，配子分离模式理论上产生18种配子类型：包括1种正常,1种平衡易位型和16种不平衡分离的配子。normalbalanceddisomy21disomy21nullisomy21Nullisomy14罗氏易位产生6种配子类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。罗氏易位的遗传风险染色体易位和生殖健康•反复流产：3-4%的反复流产患者存在染色体结构异常相互易位占61%罗氏易位占16%--Cliffordetal.1994;Franssenetal.2005•我院数据：共发现1425易位携带者，其中相互易位76.6%(1094/1428)，罗氏易位23.4%(334/1428).反复流产–75.2%(1071/1425)严重男性因素–17.2%(245/1425)卵巢功能下降–1.2%(18/1425)PGD用于易位携带者治疗的历史•产前诊断移植以来被有效的用来避免染色体异常患儿出现，但是诊断异常后流产给妇女带来心理和生理的负担，并可能导致生育障碍；•第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色体特异性DNA扩增技术成功对人胚胎性别进行诊断并获得妊娠。--Handyside,AH.Nature,1990•1998年，FISH技术被用于易位携带者的PGD诊断并获得成功--ConnCMetal.1998;MunnéSetal.1998;PierceKEetal.1998荧光原位杂交(FISH)•荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）是以利用荧光标记的特定基因或染色体片段作为探针，与染色体特定序列DNA分子杂交，可以确定分裂细胞或间期细胞对应染色体序列的位置及数目，以此检测染色体数目或结构异常。•FISH技术有以下几个特点：①安全、快速、灵敏度高；②探针能较长时间保存；③多色标记，简单直观；④可用于中期染色体及间期细胞的分析人类干细胞国家工程研究中心*中信湘雅生殖与遗传专科医院荧光原位杂交(FISH-PGD)技术流程欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE)---FISH-PGD实践指南ESHRE要求：•实验室胚胎活检技术；•遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求；•选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE)---FISH-PGD实践指南细胞核玻片固定程序：•活检卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋养层细胞(TE)；•低渗液滴中处理≥5min；•在圆圈标记对应的玻片正面部位加固定剂(Tween-20/HC1)，将低渗好的细胞转至固定剂液滴中；•待固定剂完全干燥后，可放在-20℃备用，或者直接进入下一步；•60℃烤片，30min-3h；RNase消化，蜡膜封片，湿盒中37度孵育30min-1h；•将RNase处理后的玻片依次过2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脱水；•将玻片放入变性液中，75℃预变性3-5min（目的是将DNA双链打开）；•玻片依次过75%、90%、100%酒精梯度脱水，2min/浓度，完全风干；•探针75℃变性5min；•将探针加到风干的玻片样本上，双层蜡膜封片，置于湿盒中，37℃过夜（杂交4-6h）；•玻片依次过洗涤液WS1三缸(45℃)，WS2两缸（室温），WS3一缸（室温）；•75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干；•加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE)---FISH-PGD实践指南平衡易位探针选择和淋巴细胞预实验•探针的选择：商业探针的使用需通过QC质控；自制探针也需要进行合适的QC/QA鉴定。•所有探针在应用到临床检测前都需经过细胞杂交预实验，评估特异性、亮度及弥散度；•对于所有平衡易位携带者，需要取用对应易位区段合适的探针以及探针组合对夫妻双方淋巴细胞中期分裂相及间期核进行预实验检测：至少分析20个中期分裂相，确保探针位置在正确的染色体上，易位片段能被正确指示；至少分析100个间期核，评估特异性、亮度及弥散度。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE)---FISH-PGD实践指南着丝粒探针位点特异性探针亚端粒探针•一例相互易位携带者PGD，核型为：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGD举例：平衡易位携带者预实验结果：外周血淋巴细胞培养制备的一个中期分裂相和一个间期核FISH探针：易位片段的亚端粒探针（6q13→6qter，Tel6qSpectrumOrange；10p15→10pter，Tel10pSpectrumGreen）和10号着丝粒片段的着丝粒探针（10p15→10qter,blueCEP10alphasatelliteSpectrumAqua）。•一例相互易位携带者PGD，核型为：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGD举例：平衡易位携带者FISH-PGD检测结果：不同通道滤光片下观察到的细胞核中的FISH探针荧光信号。a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号提示每个探针位点均为2个拷贝，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1个红色信号、3个绿色信号和2白色信号，分别提示6号易位片段为一个拷贝、10号易位片段为3个拷贝和10号着丝粒片段为2个拷贝，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q13→6qter单体和10p15→10pter三体不平衡产物。临近-1分离模式图ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersBiopsiedcycles257149Oocytenumber14.53±6.5313.81±6.83NumberofgoodqualityembryosonD37.12±4.186.85±4.61NumberofgoodblastocystsonD50.93±1.501.04±1.71Biopsiedembryo(median(range))10(1-30)9(1-24)Biopsiedembryos27091420N