星号活性

星号活性在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：ApoI（2）、AseI（2）、BamHI（3）、BssHII（2）、EcoRI（4）、EcoRV（5）、HindIII（1）、HinfI（6、7）、PstI（8）、PvuII（9）、SalI（8）、ScaI（2）、TaqI（10）、XmnI（2）。酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（10）。Polisky等（4）对EcoRI的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等（11）的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoRI可以切割其它任何单碱基替代序列。大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。导致星号活性的因素：较高的甘油浓度（5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100U/µg）；低盐浓度（25mM）高pH值（pH8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。抑制星号活性的方法：尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg++。产生星号活性常见的几种情况（１）甘油浓度过高（5%v/v）（２）使用过多的酶（酶用量）100Units/ugDNA（３）低离子强度25mM（４）pH值过高（pH8）（５）反应体系中含有乙醇，DMSO等有机溶剂（６）有与Mg竞争的其他离子如Mn2+等不是所有的酶都有星号活性，不同的酶产生星号活性的条件是不同的.如EcoRI甘油浓度更为敏感（注：所有酶保存液中都含有甘油，酶加的越多，甘油的浓度也随之升高）.PstI对高pH的敏感抑制星号活性的措施：克隆时需要位点完整，克隆以后需要再能切下来。基因图谱分析，特别是法医分析更加需要准确。采用下列方法可以降低或抑制星号活性：（1）用比较少的酶，只要能切开就可以了。通常情况下，研究人员使用的酶通常都是过量的。酶用量不是越多越好（2）在DNA制备过程中，通常需要使用乙醇和/或苯酚，尽可能将这些有机溶剂除去。酶切反应体系的离子浓度提高到100-150mM（3）降低体系的pH到7.0左右限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。如何避免内切酶反应进程中出现非特异性切割在非尺度条件下，有些内切酶可在与其识别序列相象但不完整相同的位点发生切割反应。这种非特异性的切割即所谓的“星号活性”。钻研标明，星号活性是限制性内切酶的普遍特征，且任何一种内切酶在特定极端条件下都会发生这种异通例序列切割。可能引起星号活性的因素之一：甘油浓渡过高（5%V/V）内切酶均贮存于50%的甘油中，因此内切酶的加入量不应该超过总体积的10%。建议应用50ul尺度反应系统，酱紫可以减少蒸发，蒸发可引起甘油浓度升高并导致星号活性。可能引起星号活性的因素之二：酶/DNA浓度比过高（100units/ugDNA）应用尽量少的酶，酱紫可以避免过度消化，也可以降低甘油浓度。可能引起星号活性的因素之三：非最适缓冲液尽量应用推举的缓冲液，缓冲液中不同的离子浓度和pH值可导致星号活性。可能引起星号活性的因素之四：反应时间过长应用尽量短的时间完成消化。长时间的温育可导致星号活性，也可导致蒸发。可能引起星号活性的因素之五：有机溶剂（eg.DMSO、乙醇、乙二醇、乙酰二甲胺、二甲基甲酰胺）如果可以，反应中不应有任何有机溶剂，DNA制备时残留的乙醇会导致星号活性。可能引起星号活性的因素之六：其余二价阳离子替换了Mg2+应该应用Mg2+作为反应中所需的二价阳离子，其余二价阳离子可能不能与内切酶的活性位点准确结合，酱紫就变动了其识别序列。在非理想的条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。有人提出,这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性(1),如果提供给相应反应条件,所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：ApoI(2)、AseI(2)、BamHI(3)、BssHII(2)、EcoRI(4)、EcoRV(5)、HindIII(1)、HinfI(6、7)、PstI(8)、PvuII(9)、SalI(8)、ScaI(2)、TaqI(10)、XmnI(2)。酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻(10)。Polisky等(4)对EcoRI的早期研究表明,在低盐浓度、高pH值条件下,EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近,Gardner等(11)的研究表明,只要识别中心的四碱基序列(AATT)不出现A/T替换,EcoRI可以切割其它任何单碱基替代序列。大多数星号活性是可以控制的,做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下,使用随酶提供的NEBuffer,NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。导致星号活性的因素：较高的甘油浓度(5%v/v)；酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同,通常为100U/µg)；低盐浓度(25mM)高pH值(pH8.0)存在有机溶剂(如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等)用其他二价离子替代镁离子(如Mn++,Cu++,Co++,Zn++等)以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感,而后者则对高pH值更敏感一些(2)。抑制星号活性的方法：尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染。将离子浓度提高到100-150mM(若酶活性不受离子强度影响)。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg++。当酶量，反应条件等改变时，有时候会出现星号活性，酶的识别序列会发生变化切得DNA跑胶像Marker一样，很多条带限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性，如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、HinfI）、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI。酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻。Polisky等对EcoRI的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoRI可以切割其它任何单碱基替代序列。大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。导致星号活性的因素：较高的甘油浓度（5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100U/µg）；低盐浓度（25mM）高pH值（pH8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）(以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。)抑制星号活性的方法：尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg++。