第10章+酶的作用机制和酶的调节

第10章酶的作用机制和酶的调节Metabolicregulationisachievedthroughanexquisitelybalancedinterplayamongenzymesandsmallmolecules,aprocesssymbolizedbythedelicatebalanceofforcesinthismobile.(SeaScapebyAlexanderColder/WhitneyMuseumofAmericanArt.NY)或者称活性中心（activecenter)——与酶活力直接相关的区域局限在酶分子的特定部位一、酶的活性部位(activesite）结合中心：与S结合决定酶促反应的专一性催化中心：促进S发生化学变化决定酶促反应的性质活性中心必需基团：与酶的催化活性直接相关的化学基团常见：His咪唑基、Ser-OH、Gluγ-COOH、Cys-SH、Asp-COOH位于活性中心活性中心以外，稳定分子构象必需基团非必需基团（一）酶活性部位的特点底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心（一）酶活性部位的特点1、活性部位只占相当小的部分几个残基+辅助因子（单纯/结合）2、在空间构象上集中到一起形成一个三维实体（单体/寡聚）3、与底物诱导契合4、位于酶表面裂缝(crevice)内6、活性中心构象具有柔性或可运动性5、通过次级键与底物结合酶AA残基活性中心AA核糖核酸酶124HHKRDE溶菌酶129DE胰凝乳蛋白酶241HDS羧肽酶A307REYZn2+胰蛋白酶223HDS（二）、研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法化合物活性部位AA残基侧链基团↓共价结合水解酶，确定一级结构位置——推测某基团是否在活性中心某基团被修饰后：判断修饰剂与活性部位结合的依据：S/竞争性I可以保护修饰剂的作用酶活力影响程度与修饰剂浓度相关酶活力改变：为必需基团（1）非特异性共价修饰利用某些化学试剂与酶蛋白中某类氨基酸残基的侧链反应而使基团的结构和性质发生改变（2）特异性共价修饰——试剂专一修饰活性部位某一AA，使酶失活。如：二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰酶（主要为蛋白水解酶及酯酶）活性部位的Ser-OH，从而使酶失活。ESerOH+(CH3)2CHOPOFO(CH3)2CHESerOPOOOCH(CH3)2CH(CH3)2酶?DFPDIP-E仅修饰活性中心Ser-OH利用DFP共价修饰法对某些蛋白水解酶进行研究，发现许多酶活性部位都含有丝氨酸，还具有相似的肽段：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro顺序。(3)亲和标记法——与S结构相似的共价修饰剂•能被专一地引入活性部位，接近S结合位点•其活泼的化学基团可与活性部位某一基团形成稳定的共价键专一性不可逆抑制剂/活性部位指示试剂CH2CHNHSO2CH3COOCH2CH3CH2CHNHSO2CH3COCH2ClRCOCH2Cl+NH32N1RCOCH2N32N1TPETPCKTPCKE-His57烷化失活His57-N3对甲苯磺酰－L－苯丙氨酸乙酯(TPE)对甲苯磺酰－L－苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）胰凝乳蛋白酶2.动力学参数测定法活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。3.X射线晶体结构分析法解析与S结合的酶分子的三维结构了解酶活性部位AA残基所处的相对位置以及与活性部位有关的其它基团4.定点诱变法利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的DNA顺序，改变其中某AA后，测定酶活性的变化。•酶催化反应的某些独特性质为许多反应所共有，可概括如下：二、酶催化反应的独特性质1.酶反应可分成两类，一类仅涉及电子转移（速率：108s-1数量级）；另一类涉及电子和质子两者或者其他基团的转移（速率：103s-1数量级）大部分反应属于第二类。2.酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介的。3.酶催化反应的最适pH范围通常是狭小的4.与底物相比较，酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些。5.酶除活性基团外，还有别的特性使反应进行更有利，并使更复杂的多底物反应按一定途径进行。主要有利条件：①在活性部位存在1个以上的催化基团，所以能进行协同催化②存在有结合部位，底物分子可以按固有方位结合在活性部位附近③在2个或2个以上底物反应时，存在1个以上的底物分子结合部位④底物结合到酶分子后，底物分子中的键产生张力，有利于过渡态复合物的形成。（一）底物和酶的邻近效应和定向效应三、影响酶催化效率的有关因素邻近效应：酶与底物形成复合物后，底物与底物、催化基团与底物之间结合于同一分子（酶）而使有效浓度极大增加，从而使反应速率大增的效应。催化中邻近效应的一个例子：（a）游离的咪唑催化乙酸对硝基苯酯的速度较慢；（b）变成分子内反应后要快24倍有机化学模式实验定向效应：反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。邻近效应和定向效应对酶促反应的影响：提高有效浓度、正确取位；变分子间反应为分子内反应。Page等认为两类效应在双分子反应中起的促进作用至少分别达到104倍。酶催化效率提高的实质：底物分子结合在酶的活性部位，作用基团互相邻近并定向，大大提高了酶的催化效率。定向效应的一个例子：邻羟苯丙酸的内酯形成，当两个甲基取代了苯环邻近的碳原子上的氢，使羧基与羟基之间更好定向时，两个速率常数之比为2.5×1011。（二）底物的形变和诱导契合酶与专一性底物结合后，酶的基团或离子使底物的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使底物分子发生形变而接近过渡态，反应容易发生。诱导契合：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。•契合后，诱导“电子云形变”:EA:B:A-:B+:电子云形变:E•这样的共价键易被酶活性中心酸碱催化或共价催化酶活性中心瞬时地向反应物提供H+/H+受体以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。（三）酸碱催化（acid-basecatalysis)在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为专一的酸碱催化或狭义的酸碱催化通过H+和OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化专一酸碱催化作用总酸碱催化作用专一的酸碱催化的表观速率常数（kobs)仅依赖pH而不受缓冲液的浓度影响；总酸碱催化的kobs除依赖pH外，还与缓冲液浓度成正比酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH)A-:H+EHE-H2OEH+OH-+H+AH+B+碱催化(-COO-、-S-、咪唑基等失电子态基团)A-:B++E-COO-A-+E-COOHE-COO-+H+在生理条件下，因H+和OH-的浓度甚低，总酸碱催化作用较为重要。很多酶的活性部位的某些功能基，能在近中性的条件下，作为催化性的质子供体或受体参与总酸碱催化作用。总酸或总碱的催化可提高反应速率102到105倍。酶分子中作为总酸碱催化的功能基团影响酸碱催化反应速率的因素有两个：酸或碱的强度（pK值）及质子传递的速率。例如咪唑基pK约为6，在中性条件下，即可作为质子供体，又可作为质子受体。同时其接受或供出质子的速率十分迅速，因此是一个重要的酸碱催化基团。——催化剂的亲核/亲电基团分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，形成共价中间复合物，降低活化能，使反应加速的机制。亲电基团——带正电荷性质的基团亲核基团——带负电荷性质的基团（四）共价催化（covalentcatalysis)分为亲核催化或亲电子催化¨-OH¨-SH酶蛋白氨基酸侧链提供各种亲核中心，以下3种最常见：丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基磷酰酶酰化酶葡糖酶酶和底物间共价键形成的例子。中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）EnzymesThatFormCovalentIntermediatesEnzymesReactingGroupCovalentIntermediate1.ChymotrypsinElastaseEsterasesSubtilisinThrombinTrypsin2.Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasePapain3.AlkalinephosphatasePhosphoglucomutase4.PhosphoglyceratemutaseSuccinyl-CoAsynthetase5.AldolaseDecarboxylasesPyridoxalphosphate-dependentenzymes1、需要金属离子的酶（几乎1/3的酶催化活性需要金属离子）（1）金属酶(metalloenzyme)•含紧密结合的金属离子（多为过渡金属离子如：Fe2+，Fe3+,Cu2+,Zn2+,Mn2+,Co3+）（2）金属-激活酶(metal-activitedenzyme)•含松散结合的金属离子（多为碱和碱土金属离子如：Na+、K+、Mg2+、Ca2+。（五）金属离子催化2、金属离子以3种主要途径参加催化过程A、参与底物反应的定向B、通过价态改变参与电子转移C、通过静电稳定/屏蔽负电荷金属离子的催化作用往往和酸的催化作用相似，有些带多价正电荷的金属离子甚至比质子的作用更强金属离子具有络合作用在中性溶液中能维持一定浓度（六）多元催化和协同效应•酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。（七）活性部位微环境的影响活性部位位于酶分子表面疏水环境的裂缝中：非极性环境中的介电常数较在水介质中低，根据库仑定律，在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高。——疏水环境有利于酶的催化作用。四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）AlexanderFleming存在鸡蛋清和眼泪中由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，含4对二硫键。溶菌酶生物学功能是催化水解细菌细胞壁多糖溶菌酶催化底物C1-O键裂解溶菌酶的结构和水解特性溶菌酶分子近椭圆形，内部几乎全部是非极性，分子表面有一个较深裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖。溶菌酶催化水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键，也催化仅由NAG残基通过b(1-4)糖苷键连接的几丁质。(NAG)3是溶菌酶的竞争性抑制剂，其最小底物为(NAG)6。水解部位只能发生在D-E之间。ABCDEF溶菌酶的活性部位的必需基团是Asp52和Glu35，第一步是质子转移,糖苷键被裂解,形成一个碳正离子中间物溶菌酶的催化机制：第二步是OH-和H+分别加合到正碳离子中间物和Glu35的侧链后,水解反应完成形成碳正离子时葡萄糖环的形变羧肽酶A（二）碱催化＋酸催化稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳胰蛋白酶蛋白质水解酶巯基蛋白酶天冬氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶锌蛋白酶胰凝乳蛋质酶凝血酶弹性蛋白酶（三）丝氨酸蛋白酶以胰凝乳蛋白酶为模型疏水口袋活性位点残基4.丝氨酸蛋白酶的催化机制催化三联体亲核攻击稳定His的正电形式乙酸硝基苯酯硝基苯酚：400nm处有强吸收乙酰酶复合物酰化作用脱酰化作用用人工底物研究胰凝乳蛋白酶催化反应机制趋同进化（convergentevolution）：催化三联体趋异进化（divergentevolution）：底物专一性－OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)（四）天冬氨酸蛋白酶（aspariticproteases）天冬氨酸蛋白酶产生于哺乳动物、霉菌和高等植物。酶在酸性pH（或有时中性）呈现活性，活性部位有两个Asp。酶的活性部位是一个深宽的裂缝，是由2个并列的结构域形成的，能容纳7个氨基酸残基天冬氨酸蛋白酶胃蛋白酶凝乳酶组织蛋白酶肾素HIV-1蛋白酶碱催化天冬氨酸蛋白酶的作用机制：蛋白酶活性的pH依赖性支持广义酸碱的催化模式活性部位存在两个高度对称的天冬氨酸残基，称为“催化二联体”HIV-I