清除自由基研究方法汇总

电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。其中ESR法和气相色谱法、HPLC法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。原理部分：1.DPPH·法测试机理DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。2.羟基自由基（·OH）1）邻二氮菲法[70]实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。2）水杨酸法[71]实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm处有强吸收。反应产生的·OH具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm处吸光度值的变化可间接测定出·OH的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。3.超氧阴离子自由基（O2-·）邻苯三酚法：超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下,邻苯三酚能发生自氧化反应,生成O2-·和有色中间产物,该中间产物在λ=320nm处有一特征吸收峰。在初始阶段,中间产物的量与时间成线性关系。当加入O2-·清除剂时,它能迅速与O2-·反应,从而阻止中间产物的积累,致使溶液在λ=320nm处吸收减弱。故可以通过测定A320值来评价清除剂对O2-·的清除作用。1.黄儒强，李娘辉，黄科礼，郑陆威，林盛，林健华.(华南师范大学生命科学学院，广东广州510631)山稔子黄酮类提取物抗自由基作用及体内抗氧化功能的研究[J].食品科学，2008,29（9）：588-590.1.3.2动物试验方法选用雄性昆明种小鼠，适应性饲养1周后，随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。低、中、高剂量组小鼠每天灌胃1次，每次0.5ml。对试验小鼠重新进行分组，分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组。各组均常规饲养，自然光照，自由饮水。除对照组外，其他各组进行如下处理：每天给药1次，每次每只灌胃0.5ml。1.3.3动物实验指标测定及统计分析连续试验3周，最后一次给药后，禁食2h，摘取各小鼠眼球取血，离心分离，吸取上层血清，用于SOD、GSH-Px、MDA的测定。以对照组为对照，对各试验组数据用SPSS11.0作单因素方差分析和均数间多重比较。1.3.4清除羟自由基[7]取6支10ml比色管，分别依次加入0.3ml7.5mmol/L硫酸亚铁铵溶液、0.3ml7.5mmol/L邻二氮菲溶液、1mlpH7.47Tris-HCl缓冲溶液，在2、3、4、5、6号比色管中各加入0.2ml7.5mmol/LH2O2，然后在3、4、5、6号比色管中分别加入0.3ml浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml的山稔子黄酮类提取物，用重蒸水定容至刻度，在37℃的水浴中，反应1h，在450～550nm波长范围内扫描，得最大吸收波长，并在此波长下测光密度值，根据下式计算羟自由基的清除率：式中，OD样品、OD未损及OD损，分别为加入提取液的羟自由基体系、不加H2O2及加入H2O2的光密度值。1.3.5对超氧离子自由基(O2·)的抑制率取4支10ml的比色管，各加入2.0mlpH8.34Tris-HCl缓冲溶液，依次分别加入1.0ml浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml的山稔子黄酮类提取物，最后都加入1.0ml0.2mmol/L邻苯三酚，重蒸水定容至刻度。在吸收波长322nm处每隔30s记录一次光密度值,根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率：式中，ΔOD1/Δt为邻苯三酚自氧化时反应速率，ΔOD2/Δt为加入提取液后邻苯三酚自氧化反应速率。2.陈旭丹,于晓莹,郝晓萌,陆曦,王威.(天津师范大学化学与生命科学学院,天津300074)三种黄酮类化合物抗自由基的研究[J].食品研究与开发2007,128（6）：20-22.连苯三酚法和DPPH法对其清除活性自由基的能力进行研究。1.2.2连苯三酚法1.2.2.2清除超氧自由基的测定步骤分别将金银花和葛根的提取液配制成百分浓度为20%、30%、40%和10%、20%、30%的待测液。用10mmol/LHCl溶液配制成1.5mmol/L的连苯三酚溶液;Tris-HCl缓冲溶液为50mmol/L,pH值为8.2;各样品浓度为1mmol/L。按表1加样于具塞比色管中,迅速摇均后每隔30s,以10mmol/LHCl溶液为参比液,光程1cm,用紫外-可见分光光度计于320nm处测定相应吸光度值,至3min止。取3次试验的平均值计算清除率。清除率计算公式:S=[1-(Aj-Ai)/A0]×100%S:清除率;Ai:待测液在320nm的吸光值;Aj:待测液与连苯三酚混合物的吸光值;A0:连苯三酚在320nm的吸光值。1.2.3DPPH法1.2.3.1原理DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl或1,1-二苯基苦基苯肼)分子结构图,见图。在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其乙醇溶液(显深紫色)在517nm处有最大吸收峰,见图。当与抗自由基活性物质作用时,其孤对电子被配对,因而吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。1.2.3.2清除自由基的测定步骤分别将金银花、葛根和栗子叶的提取液配制成百分浓度为10%、20%、30%、40%、50%的待测液。DPPH用70%的乙醇配制成6.5×10-5mol/L的溶液;按表2加样于具塞比色管中,摇匀反应30min后,用紫外-可见分光光度计,光程1cm,70%乙醇溶液为参比液,在517nm处分别测定吸光度值A0、Ai、Aj。按下列公式计算清除率:S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%S:清除率;Aj:待测液在517nm的吸光值;Ai:加入DPPH待测液后的吸光值;A0:DPPH在517nm的吸光值。3.牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究（华南理工大学硕士研究生论文）4.3.2水解物清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定本实验采用邻苯三酚自氧化法[89]测定样品清除超氧阴离子的活性。取浓度为80g/L的水解样品溶液0.2mL，加入pH8.2，50mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.5mL，蒸馏水4mL，混匀，置于27℃保温10min，作为试剂A；取0.3mL3mmol/L的邻苯三酚溶液，置于25℃下保温10min，作为试剂B；以试剂A与0.3mL10mmol/LHCl溶液的混合液作为空白调零后，将试剂A与试剂B迅速混合，在320nm处测定3min内吸光度的变化，回归求出吸光度变化斜率K1。以蒸馏水代替水解样品溶液作为对照样品重复上述过程，得出吸光度变化的斜率为K0；计算清除超氧阴离子的能力：式中：K0——空白对照液的吸光度变化斜率K1——加入水解液后的吸光度变化斜率4.3.3水解物清除羟基自由基（·OH）能力的测定采用水杨酸法测定水解物清除羟基自由基（·OH）能力[90]。在反应体系中加入10mL9mmol/LFeSO4溶液和10mL9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，然后加入浓度为80g/L的水解样品溶液10mL，最后加入10mL8.8mmol/LH2O2启动反应。对照液中以10mL蒸馏水替换同体积的水解液，37℃条件下保温0.5h。以蒸馏水为参比液，在510nm测定其吸光值。计算清除羟基自由基的能力：式中：A0——空白对照液的吸光值Ax——加入水解液后的吸光值Ax0——水解液的本底吸光值4.3.4水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的测定[91]二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）法是一种广泛用于筛选抗氧化剂的方法，用该法测定了水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的能力。将2mL浓度为80g/L的水解液与2mL0.1mmol/L的DPPH·-乙醇溶液混匀置于试管中,静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光度Ax；在对照液中，以2mL无水乙醇代替水解液，静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光值A0；取相同浓度的水解液2mL和2mL的无水乙醇混匀，以无水乙醇作为参比测定其本底吸光值Ax0。计算清除二苯代苦味酰基自由基的能力：式中：A0——空白对照液的吸光值Ax——加入水解液后的吸光值Ax0——水解液的本底吸光值4.白腐菌降解木质纤维素过程中清除自由基物质产生研究（华中科技大学硕士学位论文）2.2.5羟自由基清除率测定（1）邻二氮菲法[70]实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。操作步骤：10mL反应体系中，依次加入5mmol/L的邻二氮菲1.5mL，PH7.40.5mol/L的磷酸缓冲液3mL，7.5mmol/L的FeSO41.0mL，立即混匀。再加入待测样品3mL，0.1%H2O21.0mL，用蒸馏水定容至10mL。混匀后，于37℃水浴1小时，然后在510nm波长下测其吸光值。计算方法：自由基清除率E＝（As－A0）/（A1－A0），其中As为加了待测样品和H2O2所测得的吸光值，A1为没有加样品和H2O2所测得的吸光值，A0为没有加样品、加了H2O2所测得的吸光值。（2）水杨酸法[71]实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton反应体系中的·ＯＨ，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。操作步骤：10mL刻度具塞试管中，依次加入10mmol/L水杨酸0.5mL，0.4mol/LpH7.4的磷酸缓冲液3mL，3.8