医学动物实验操作技术

医学动物实验操作技术动物实验：动物实验是用实验动物作为人的替身进行各种生命科学实验的过程。动物实验操作技术：是实施动物实验的重要手段，在不同的研究领域有其不同的目的和应用，一些基本操作技术是共同的，基本的动物实验技术需要训练。内容：动物实验的准备、动物实验基本操作技术、动物实验后的管理技术以及应该注意的影响动物实验效果的因素等动物实验结果ByChenMin-li动物的反应：R＝(A+B+C)×D±E式中：R——实验动物的总反应A——实验动物种的共同反应B——动物品种及品系特有的反应C——动物个体反应（个体差异）D——环境的影响（包括实验处理）E——实验误差(实验操作相关)第一节动物实验前的准备一、动物实验相关的准备实验目的明确（课题设计）：研究、申报新药资料动物实验相配套设备、仪器、试剂标准实验动物饲养设施二、实验动物相关的准备实验动物的质量合格证明适量的饲料和垫料（高脂等特殊饲料）运输中的各种因素对实验动物的影响，并应查看运输检疫证明动物需要隔离观察（一般3～7d的适应观察）三、实验动物的分组随机化原则：样本具有极好的代表性，非实验因素方面具有极好的均衡性,提高实验资料的可比性与结论的说服力。完全随机化的效果是否永远最好?不一定。关键取决于样本含量的大小。若样本含量很大,完全随机化的效果比较理想;若样本含量比较小,有时完全随机化的结果可能会出现某些偏差。例如：24只小鼠,其中16只雌性,8只雄性,若采用完全随机化方式均分成2组,则有可能一组中的12只小鼠全是雌性的,另一组中有4只雌性、8只雄性小鼠。“性别”这个重要的非实验因素就严重地影响实验。此时,宜采用“分层随机化”。随机化的方法有多种,可以查“随机数字表”、“随机排列表”或查“用计算机产生的伪随机数字表”四、实验动物的编号与标记1、染色法：用化学试剂或药品在实验动物体表的不同部位进行涂染，并用不同颜色区别各组动物。编号原则是先左后右，从前到后，从上到下。有时用两种颜色一个代表十位、一个代表个位。常用的染色剂有3%~5%的苦味酸（黄色）、2%的硝酸银溶液（咖啡色）、0.5%的中性品红溶液（红色）和煤焦油酒精溶液（黑色）。2、耳缘剪孔法：是在动物的耳边缘剪出不同的缺口或打成不同的小孔进行标记的方法。为防止孔、口愈合，一般在打孔后用消毒的滑石粉涂抹在孔、口局部。由打孔或剪切的位置和孔数代表编号，一般在耳内按上、中、下打孔，分别代表1、2、3，在相应位置剪缺口代表4、5、6，剪两个缺口代表7、8、9，无孔或缺口为10。一般左耳代表个位数、右耳代表十位数。3、烙印法：用烙印钳或刺针将号码刺在或烙印在动物无体毛或明显部位，如耳、面、鼻部及四肢等，然后用溶在酒精中的黑墨在针刺处涂抹。这种方法适用于大中型实验动物，操作时要注意防止感染。（四）号牌法：用特制的金属号牌固定在实验动物的耳上或颈项部，挂牌时要注意避开血管。此法适用于小动物,特别是转基因动物的培育和实验。（五）笼子编号法：不在动物身体上作标记而把装动物的笼子进行编号，也叫替代法。第一节、实验动物的抓取与固定第二节实验动物的抓取和固定1、小鼠的抓取保定：器材：小鼠饲养盒+面罩1套。方法步骤：1、用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部将小鼠提起，放在饲养合的面罩上。2、用左手拇指和食指迅速、准确地捏住小鼠的两耳后、颈背部的皮肤，将小鼠提起。3、翻转左手掌，以左手掌心和中指夹小鼠背部的皮肤，使小鼠整个呈一条直线。4、用左手无名指压住小鼠背部的皮肤，小指压住小鼠的尾巴根部。5、松开捏住小鼠尾巴的右手拇指和食指。手术固定法：用乙醚等麻醉药品麻醉后，用长20~30cm的线绳分别系在四肢上，再把四肢的线绳分别系在固定板四角的钉子上，并且在头部上颚切齿的地方牵一根线绳达到完全固定。在静脉给药时，先根据小鼠的大小选择合适的固定器，打开鼠筒盖，把小鼠放在里面，只露出尾巴；或者用倒放的烧杯将鼠扣住，只露出尾巴并压住。2、大鼠的抓取与固定抓取方法：4~5周龄以内的大鼠同小鼠；周龄较大的大鼠其尾部皮肤容易被剥脱，所以用左手从背部中央到胸部捏起来抓住。抓取时最好带防护手套，但手套不宜过厚。手固定法：同小鼠。手术固定法：同小鼠。静脉给药或采血时同小鼠。三、豚鼠的抓取与固定抓取方法：抓取幼小豚鼠时，用手捧起来；成熟的大豚鼠，用手大把抓起胸肋部即可。注意不能粗野，更不能抓取腰腹部，这样容易造成肝破裂而死亡。手固定法：⑴将左手的食指和中指放在豚鼠颈背部两侧，拇指和无名指放在肋部，分别用手指夹住左右前肢抓起来。⑵反转左手，用右手的拇指和食指夹住右后肢，用中指和无名指夹住左后肢是豚鼠整体伸直成一条直线。⑶一个人固定操作时，坐在椅子上，用右手拿着豚鼠的后肢夹在两腿之间，用大腿代替右手夹住。手术固定法：同大、小鼠。方法步骤：1、先用左手轻轻扣、按住豚鼠背部。2、顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环箍其颈部。3、用右手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取保定。四、家兔的抓取与固定抓取方法：用一只手大把抓住颈背部皮肤提起来，另一只手托住其臀部，让其重心落在托其臀部的手上，运送时，还要抓住颈肩部皮肤抱着兔子运送。手固定法：在灌胃给药时，人坐在椅子上，用一只手抓住颈背部皮肤，另一只手抓住两后肢放在两腿之间，大腿夹住兔子的下半身，用空着的手抓住两前肢固定之，抓住颈背部的手同时捏着两只耳朵，不让头部转动。固定器固定法：耳静脉给药或采血时用盒式固定法；从颈动脉采血或手术实验时用台式固定法。盒式固定法：把兔子放在盒子里，只露出头部，用转扭拧固定器固定家兔。台式固定法：将麻醉的兔子仰卧，用纱布条依次将四肢捆绑固定于固定台的两侧，然后把头部放在金属制的首伽和咀环上固定。兔的抓取保定方法1：步骤：1、用右手把兔的两耳拿在手心并抓住颈后部皮肤，把兔提起。2、然后用左手托住兔的臀部。方法2：器材：兔保定架步骤：1、打开保定架的上盖，抓取并将兔放进架内，迅速关上保定架的上盖。2、右手抓住兔耳朵将头部拉过保定架的卡栓，将兔的脖子保定。3、如果兔挣扎，可用手在它的背上轻轻抚摸，使其安静。五、犬的抓取与固定抓取方法：先给犬带上系有铁链条的脖套，对于性情凶猛的犬，要用特制的钳式长柄犬夹夹住犬颈部将犬按倒后，再系脖套和链条。手固定法：首先绑住犬嘴，方法是饲养员或犬主人从侧面靠近并轻轻抚摸其颈部皮毛，然后迅速用布带绑住犬嘴，布带从下颌绕到上颌打一个结，再绕到下颌打一个结，然后将布带绕到头后颈，在颈后部再打一个结，最后打一个活结，对于未经驯服的犬，可用长柄犬夹夹住犬颈部按倒后强制绑嘴。手术台固定法：麻醉后，松开布带，将犬仰卧在手术台上，先固定四肢，再固定头部。六、猴的抓取与固定抓取方法：从笼内抓取时，饲养人员应右手持短柄网罩，左臂紧靠门侧，以防止笼门敞开时猴逃出。右手将网罩塞入笼内，由上而下罩捕。当猴被罩住后，应立即将网罩翻转取出笼外，罩猴在地，由罩外抓住猴的颈部，清掀网罩，再提取猴的手臂反背握住。固定方法：1.徒手固定：将猴两前肢反背其背后，操作者用一只手握着，用另一只手将猴两后肢捉住即可固定。2.固定架固定：使用“猴限制椅”或“猴固定架”进行固定七、猪的抓取与固定抓取方法：小猪常采用双手提起后肢，两膝夹住猪背倒立固定；成猪可采用站立固定。固定方法：可将猪仰放在“V”字型槽内固定，也可用木制三角固定架和帆布吊兜固定（挖四个孔使其四肢下伸）。如没有三脚架，也可以用犬固定台。一、常用的麻醉剂（一）挥发性麻醉剂包括乙醚、氯仿、异氟烷（Isoflurane）。（二）非挥发性麻醉剂包括苯巴比妥钠、戊巴比妥钠(Pentobarbitol)、硫喷妥钠、氨基甲酸乙脂、水合氯醛、氯胺胴（Ketamine）、噻啦嗪（Xylazine）、速眠新、乌拉坦。（三）中药麻醉剂包括洋金花、氢溴酸东莨菪碱等。第三节、实验动物的麻醉二、动物的麻醉方法（一）全身麻醉1.吸入麻醉：多采用乙醚做麻醉药。把带有乙醚的棉球放入玻璃容器内，挥发后将动物放入容器内4~6分钟，动物失去运动力后立即取出动物以避免麻醉过深致死。此法多用于短期操作性实验，乙醚麻醉的优点是苏醒快，但是对呼吸道刺激性大，长时间容易窒息死亡。2.注射麻醉：大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法进行全身麻醉，犬、猫、兔等既可腹腔注射也可静脉注射给药。注射时，先用麻醉药总量的2/3，密切观察动物生命体征的变化，如已经达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑制大脑呼吸中枢导致动物死亡各种动物常用的全身麻醉剂的剂量及途径剂量(mg/kg体重)动物注射戊巴比巴比苯巴比硫喷异戊巴氯胺酮氯醛糖乌拉坦途径妥钠妥钠妥钠妥钠妥钠比妥钠(20%~25%)(1%~3%)(1%~2%)(5%~10%)(10%)小鼠i.p50~80200/15~20100100~200//i.m///////1350大鼠i.p40~50200/40~100100100~200550/i.m///////1350s.c//100~110////800~1000豚鼠i.p30~50100//100///i.m///20~50///1350兔i.p25~40///80~120///i.v20~30225~300/15~2040~50/80~100750~1000犬i.p30//20~5080~10010~40//i.v3022550~10015~2040~50/60750~1000口服/350////1001500注:i.p指腹腔注射,i.m指肌肉注射,s.c指皮下注射,i.v指静脉注射（二）局部麻醉1.表面麻醉:利用局部麻醉药的组织穿透作用，透过粘膜，阻滞浅表的神经末梢，称为表面麻醉。常用利多卡因，眼部用药点滴、鼻内用要涂敷、咽喉气管用药喷雾、尿道灌注给药。2.区域阻滞麻醉：在手术区内四周和底部注射麻醉药阻断疼痛的向心传导，称为区域阻滞麻醉。常用普鲁卡因。3.神经干(丛)阻滞麻醉：在神经干(丛)的四周注射麻醉药，阻滞其传导，使其所支配的区域疼痛感觉消失，称为神经干(丛)阻滞麻醉。常用利多卡因。4.局部浸润麻醉：沿手术切口逐层注射局部麻醉药，阻滞组织中的神经末梢，称为局部浸润麻醉。常用普鲁卡因。三、麻醉注意事项1.有些麻醉药，如乙醚挥发性很强，易燃，使用时应远离火源，平时应妥善保存。2.应特别注意各种麻醉药的剂量和给药途径，切莫因药量过大而引起中毒或死亡。3.注射时，一般要求缓慢注入，并随时观察动物肌肉的紧张性、角膜反射、呼吸频率、疼痛反射等指标。4.注意保温，采取实验桌内装灯、电褥、台灯照射等。5.万一麻醉过量，根据不同情况采取措施，如施行人工呼吸、给予苏醒剂或注射强心剂、咖啡因、肾上腺素、可拉明等，也可以静脉注射5%温热的葡萄糖溶液。一、小鼠的给药方法：(一)灌胃给药（经口给药）原理：将药液直接注入小鼠的胃内。器材：小鼠灌胃针1支、注射器1支、小鼠饲养盒+面罩1套、生理盐水、烧杯。第四节给药方法方法步骤：1、将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液。2、左手捉持小鼠，使小鼠头部向上。3、右手将灌胃针头尖端从小鼠口角处进针放进小鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入小鼠的胃内。灌胃针插入约3cm.4、用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入小鼠的胃中。最大剂量：0.4ml／10g体重。注意：在灌胃过程中，避免误插入气管。（二）注射给药1、皮下注射给药：原理：将药液注入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环。器材：1m1注射器1支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球。方法步骤：(1)注射部位：选小鼠项背部的皮下。(2)常规消毒注射部位的皮肤，用注射针头取一锐角角度刺入皮下，(3)将针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。注射量：0.01ml—0.03ml／g体重。2、肌肉注射给药原理：将药液注入动物的肌肉组织，经毛细血管吸收进入血液循环。器材：1ml注射器1支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球。方法步骤：(1)操作时1人先将小鼠